Porcine Cumulus Oocyte Complex Isolation: 체외 수정을 위해 돼지 난포 난포에서 Cumulus Oocyte 복합체를 분리하는 기술

초록

출처: Gorczyca, G. et al., 돼지 난모세포 캡슐화를 위한 단백질 분해 분해 알긴산 하이드로겔 및 소수성 미생물 반응기. J. Vis. 특급 (2020).

이 동영상은 돼지 난소에서 적운-난모 세포 복합체 또는 COC를 분리하는 기술에 대해 설명합니다. 분리된 온전한 COC는 불임 치료법을 개발하기 위한 보조 생식 기술인 체외 수정을 수행하는 데 사용할 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 돼지 적운-난모 세포 복합체의 분리

1. 난포 분리를 위한 물질을 수집하려면 지역 도축장에서 사춘기 이전 금자(약 6-7개월, 무게 70-80kg)에서 돼지 난소를 절제합니다. 각 실험에서 적운-난모세포 복합체(COC) 분리를 위해 10마리의 동물에서 약 20개의 돼지 난소를 선택합니다.
   메모: 각 난소에서 3-5개의 난포가 생성된다고 가정하면 총 난포 수는 60개에서 100개까지 다양합니다.
2. 1% 항진균 용액(AAS)이 함유된 멸균 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.4, 38°C)가 있는 보온병에 난소를 넣습니다. 실험 물질을 1시간 이내에 실험실로 운반하여 항생제가 함유된 멸균 PBS로 두 번 헹굽니다.
3. 난소를 헹군 후 취급 매체(HM)(Table of Materials)로 채워진 비커로 옮기고 모든 조작 시간 동안 38°C의 인큐베이터에 보관합니다.
   메모: 난모세포 취급 중 최적의 결과를 얻으려면 2.5% 항생제/AAS 및 10% 소 태아 혈청(FBS)을 첨가한 DMEM/F12 배지(취급 배지, HM)에서 모든 절차를 수행하고 환경 내 CO₂ 수준, 온도 조절 장치가 있는 가열 테이블(38°C) 및 층류 후드 아래에서 pH를 제어하여 박테리아 오염을 최소화합니다.
4. 큰 돼지 여포(직경 6-8mm)에서 흡인 및 원심분리를 통해 실온에서 10분 동안 10분 동안 난 포액(FF)을 수집합니다. 그 후 0.2μm 멤브레인 기공 필터에 장착 된 멸균 주사기를 사용하여 상층액을 여과하고 -80 ° C에서 스냅 동결합니다.
   메모: 여포액 흡인을 위해 인슐린 주사기(u-40)를 사용합니다.
5. COC 분리를 위해 건강한 중간 크기의 난포(직경 4-6mm)만 선택해야 합니다.
   메모: 균질한 난형과 다층(최소 3-4개)의 소형 적운을 가진 온전하고 둥근 난모세포를 가진 등급 I의 COC는 추가 3D IVM 절차에 적합한 것으로 간주됩니다.
6. COC를 분리하려면 2-3개의 난소를 HM으로 채워진 직경 10cm의 멸균 페트리 접시로 옮깁니다. 아래 절차 중 하나에 따라 중간 크기의 난포에서 COC를 분리합니다.
   1. 멸균 수술 용 블레이드 15C로 돌출 된 난포 표면을 부드럽게 자릅니다. 이로 인해 COC와 함께 여포액이 페트리 접시로 흘러 나옵니다.
   2. 일회용 주사기에 부착된 5/8" 크기의 28G 바늘을 사용하여 여포 함량을 흡인하고 페트리 접시에 옮깁니다.
      메모: 난소 조직의 잔해는 버리십시오. 후속 분리 단계는 실체 현미경 하에서 수행됩니다.
7. 3-5 60mm IVF 페트리 접시를 준비합니다.
   1. 중앙 웰에 HM 1mL를 추가하고 외부 고리에 HM 3-4방울(방울당 50μL)을 놓습니다.
   2. 그런 다음 폴리카보네이트 마이크로피펫을 사용하여 손상되지 않은 COC를 외부 고리의 HM 방울로 이동하여 3-4회 동안 짧게 헹굽니다.
   3. 마지막에는 개별적으로 중앙 우물로 옮깁니다. 추가 절차를 위해 이 IVF 플레이트를 인큐베이터에 보관하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
일반
항생제 항진균제(100배) 100ml	써모 피셔	15240062	취급 매체를 위한 2.5% 마지막 농도. PBS에서 1% (단계 1.2)
DMEM/F12 (500ml)	시그마-알드리치	D8062	취급 매체
FCS(100ml)	써모 피셔	16140063	취급 매체를 위한 10% 최종 농도. (단계 : 1.5)
PBS(1배, pH 7.4) 500ml	써모 피셔	10010023
성숙 매체
hCG (10,000 U의 1 바이알)	시그마-알드리치	CG10
증권 시세	바이오벤더	RP1782721000
특정 도구, 도구
30mm Pteri 접시	증권 시세	93040
60mm IVF 페트리 접시	송골매	353653
부 화기	파나소닉	MCO-170AIC-PE	다른 브랜드도 사용할 수 있습니다.
멸균 페트리 접시 (10cm)	NEST 생명공학	704002
보온병	케추아어	5602589	다른 브랜드도 사용할 수 있습니다.

시리즈 표시기 표시기 년