Liquid Marble Microbioreactor 시스템: 돼지 난모세포 캡슐화를 위한 3D 배양 프로토콜

초록

출처: Gorczyca, G., et al. 돼지 난모세포 캡슐화를 위한 단백질 분해 알긴산 하이드로겔 및 소수성 미생물 반응기. J. Vis. 특급 (2020).

이 비디오에서는 소수성 미생물반응기에서 돼지 난모세포를 캡슐화하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 초소수성 플루오르화 에틸렌 프로필렌(FEP) 미생물 반응기에 캡슐화

.

참고: 모든 체외 성숙(IVM) 절차가 온도 조절 방식으로 제어되는 테이블에서 수행되고 적운-난모 세포 복합체(COC)가 취급 내내 38°C로 유지되는지 확인하십시오.

1. 30μm
   의 FEP 분말 베드 평균 입자 크기 5g을 포함하는 1mm 페트리 접시를 준비합니다. 알림: 신선한 FEP 분말을 사용하는 것이 중요합니다. 재사용된 FEP는 응집되어 덩어리를 형성하는 경향이 있습니다.
2. 3-5 COC를 포함하는 성숙 매체(MM)(부피 ~30μL)의 단일 방울을 FEP 분말의 베드에 분배합니다. 플레이트를 원을 그리며 부드럽게 회전하여 이러한 입자가 액체 방울의 표면을 완전히 덮고 형성된 액체 구슬(LM)을 확인합니다.
3. 1,000 μL tip.
   의 피펫을 사용하여 성형된 LM을 픽업합니다. 참고: 피펫 팁을 LM 직경(4-5mm)에 맞게 가장자리에서 자릅니다. 이렇게 준비된 팁의 대략적인 직경은 LM의 직경보다 약간 커야 합니다.
4. 60mm 체외 수정(IVF) 페트리 접시 여러 개를 준비합니다. 습도 챔버를 준비하기 위해 외부 링에 3-4mL의 멸균수를 추가합니다. 다음으로 LM 1개를 중앙 우물에 넣습니다.
   참고: 이 절차는 좋은 수작업 기술과 정확성을 필요로 합니다 - 대리석을 부주의하게 놓거나 낮은 높이에서 떨어뜨리면 파괴됩니다.
5. 5% CO₂ 인큐베이터에서 38°C에서 4일 동안 구슬을 배양합니다.
   1. 절차에 따라 매일 매체를 교체하십시오: 각 LM에 30μL의 MM을 적용하면 액체가 직접 접촉하면 코팅된 FEP 분말의 소수성을 방해하기 때문에 확산이 발생합니다. 대리석 함량이 용해되면 생물 반응기에서 방출 된 COC를 페트리 접시의 새로운 MM 한 방울로 옮깁니다 .
      참고: 방출된 COC를 정확하게 전달하려면 폴리카보네이트 마이크로피펫을 사용하십시오.
   2. FEP 입자를 제거하기 위해 MM을 여러 번 세척(3-4회) 한 후 30μL의 새 MM과 함께 FEP 파우더 베드에 옮깁니다. 플레이트를 원을 그리며 부드럽게 회전하여 분말 입자가 액체 방울의 표면을 완전히 덮고 새로운 LM을 형성하도록 합니다.
   3. 1,000 μL 팁이 있는 피펫을 사용하여 성형된 LM을 픽업합니다.
   4. 습도 챔버를 준비하기 위해 외부 링에 3-4mL의 멸균수를 추가합니다. 다음으로, 하나의 LM을 IVF 페트리 접시의 중앙 웰에 놓습니다.
      참고: FEP 분말의 투명 코팅으로 광학 현미경을 사용하여 LM 함량을 모니터링할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
성숙 매체
hCG (10,000 U의 1 바이알)	시그마-알드리치	CG10
증권 시세	바이오벤더	RP1782721000
DMEM/F12 (500ml)	시그마-알드리치	D8062	성숙 매체
FCS(100ml)	써모 피셔	16140063	성숙 배지에 대한 10% 최종 농도
리퀴드 마블
FEP	다이니언 GmbH 3M AdMD	A-66670
특정 도구, 도구
30mm 페트리 접시	증권 시세	93040
60mm IVF 페트리 접시	송골매	353653
Ez-Grid 프리미엄 셀 핸들링 피펫터	RI 생명과학 전공	8-72-288
이지 팁	RI 생명과학 전공	8-72-4155/20년
부 화기	파나소닉	MCO-170AIC-PE	다른 브랜드도 사용할 수 있습니다.
멸균 페트리 접시 (10cm)	NEST 생명공학	704002

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