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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 초소수성 플루오르화 에틸렌 프로필렌(FEP) 미생물 반응기에 캡슐화
.
참고: 모든 체외 성숙(IVM) 절차가 온도 조절 방식으로 제어되는 테이블에서 수행되고 적운-난모 세포 복합체(COC)가 취급 내내 38°C로 유지되는지 확인하십시오.
- 30μm
의 FEP 분말 베드 평균 입자 크기 5g을 포함하는 1mm 페트리 접시를 준비합니다.
알림: 신선한 FEP 분말을 사용하는 것이 중요합니다. 재사용된 FEP는 응집되어 덩어리를 형성하는 경향이 있습니다.
- 3-5 COC를 포함하는 성숙 매체(MM)(부피 ~30μL)의 단일 방울을 FEP 분말의 베드에 분배합니다. 플레이트를 원을 그리며 부드럽게 회전하여 이러한 입자가 액체 방울의 표면을 완전히 덮고 형성된 액체 구슬(LM)을 확인합니다.
- 1,000 μL tip.
의 피펫을 사용하여 성형된 LM을 픽업합니다.
참고: 피펫 팁을 LM 직경(4-5mm)에 맞게 가장자리에서 자릅니다. 이렇게 준비된 팁의 대략적인 직경은 LM의 직경보다 약간 커야 합니다.
- 60mm 체외 수정(IVF) 페트리 접시 여러 개를 준비합니다. 습도 챔버를 준비하기 위해 외부 링에 3-4mL의 멸균수를 추가합니다. 다음으로 LM 1개를 중앙 우물에 넣습니다.
참고: 이 절차는 좋은 수작업 기술과 정확성을 필요로 합니다 - 대리석을 부주의하게 놓거나 낮은 높이에서 떨어뜨리면 파괴됩니다.
- 5% CO2 인큐베이터에서 38°C에서 4일 동안 구슬을 배양합니다.
- 절차에 따라 매일 매체를 교체하십시오: 각 LM에 30μL의 MM을 적용하면 액체가 직접 접촉하면 코팅된 FEP 분말의 소수성을 방해하기 때문에 확산이 발생합니다. 대리석 함량이 용해되면 생물 반응기에서 방출 된 COC를 페트리 접시의 새로운 MM 한 방울로 옮깁니다 .
참고: 방출된 COC를 정확하게 전달하려면 폴리카보네이트 마이크로피펫을 사용하십시오.
- FEP 입자를 제거하기 위해 MM을 여러 번 세척(3-4회) 한 후 30μL의 새 MM과 함께 FEP 파우더 베드에 옮깁니다. 플레이트를 원을 그리며 부드럽게 회전하여 분말 입자가 액체 방울의 표면을 완전히 덮고 새로운 LM을 형성하도록 합니다.
- 1,000 μL 팁이 있는 피펫을 사용하여 성형된 LM을 픽업합니다.
- 습도 챔버를 준비하기 위해 외부 링에 3-4mL의 멸균수를 추가합니다. 다음으로, 하나의 LM을 IVF 페트리 접시의 중앙 웰에 놓습니다.
참고: FEP 분말의 투명 코팅으로 광학 현미경을 사용하여 LM 함량을 모니터링할 수 있습니다.