돼지 각막 내피 세포의 레이저 보조 선택적 절제: 생체 외 연구를 위한 집속 돼지 각막 내피 손상을 유도하는 기술

초록

출처: Holzhey, A. et al., 각막 내피 세포 손실의 비침습적 레이저 보조 실험 모델 개발. J. Vis. 특급 (2020)

이 비디오는 돼지 눈의 각막 내피 세포를 선택적으로 손상시키는 비침습적 레이저 보조 절차를 보여줍니다. 개발된 내피 세포 손상 생체 외 모델은 각막 내피 질환을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 장기 배양 및 레이저 치료 준비

1. 지역 도살장에서 갓 적출된 돼지 눈을 얻습니다. L-글루타민, 피루브산나트륨, 페니실린/스트렙토마이신(1%) 및 돼지 혈청(10%)이 보충된 고포도당이 함유된 Dulbecco의 변형된 독수리 배지(DMEM)에서 서늘하게(4°C) 시원하게(4°C) 유지하십시오.
2. 가위로 세포 외 조직을 제거하고 5% 포비돈-요오드 점안액에 눈을 5분 동안 담가두었다가 멸균된 인산염 완충 식염수(PBS)에 넣어 사용합니다.
3. 각막 흉터, 부종 및 기타 혼탁과 같은 주요 전방 분절 병리학을 스펙트럼 도메인 광 간섭 단층 촬영 장치로 눈을 스크리닝합니다(Table of Materials).
4. 파장이 1,064nm이고 공기 중 초점 직경이 10μm인 Nd:YAG 레이저(Table of Materials)가 장착된 슬릿 램프 장치 앞에 눈을 배치합니다.
   메모: 최적의 포지셔닝을 위해 3D 프린팅 고정 장치가 사용되며, 이 장치는 눈에 너무 많은 압력을 가하지 않고 눈을 단단히 고정하도록 설계되었습니다(그림 1).
5. 12배의 배율을 사용하고 조명을 편향시켜 개별 각막층을 시각화합니다.
6. 내피 세포의 선택적 절제를 위해 펄스 에너지(예: 1.6mJ)와 초점 포인트(예: 0.16mm)를 설정합니다.
7. 가장자리 가까이에 투명한 각막 천자를 놓고 점탄성(Table of Materials)을 주입하여 전방을 안정화합니다.
8. 8mm 트레핀을 사용하여 레이저 처리된 중앙 각막을 절제합니다.
9. 절제된 각막을 내피 부위가 위를 향하도록 하여 12웰 플레이트의 웰에 넣고 최대 3일 동안 37°C에서 3mL의 전체 배지에 검체를 배양합니다.
   메모: 이 단계에서 잠재적인 세포보호제를 배지에 추가할 수 있습니다.

결과

그림 1: 실험 설정.(A) 눈은 부분적으로 3D 프린팅된 고정 장치에 고정되어 레이저 빔에 대해 정확한 정렬이 가능했습니다. (B) 레이저 치료 전에, 주요 전안부 병리를 확인하기 위해 전안부 광간섭 단층촬영 장치로 조직을 평가했습니다. 초점 레이저 포인트의 위치는 0.0mm(검은색 별표), 0.1mm(빨간색 별표) 및 0.2mm(파란색 별표)에 대한 예시로 표시됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
배런 진공 트레핀	카테나	K20-2058
저온 유지 장치	라이카	CM 3050S
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - 고포도당	파아	E-15009
눈 홀더	자신	해당 사항 없음
도립 현미경	라이카	DMI 6000 B
KH2PO4	머 크	529568
나2HPO4	머 크	1065860500
Nd:YAG 레이저	자이스 메디텍	visuLAS YAG II 플러스
OCT 티슈 텍	사쿠라 파인테크니컬	4583
페니실린-스트렙토마이신	시그마-알드리치	P4333
인산염 완충 식염수(PBS)	지브코	10010056
돼지 세럼	시그마-알드리치	12736씨
Spectral-domain optical coherence tomograph(스펙트럼 영역 광간섭 단층촬영)	하이델베르크 엔지니어링	스펙트랄리스
조직 배양 플레이트 12웰	사르슈테트	833921
점탄성	옴니비전	메토셀

조 년