Performing Injection into Palpebral Portion of the Superior Lacrimal Gland: A Technique for Inducing Dry Eye Disease in Rabbit Model

초록

출처: Honkanen, R. A., et al. Concanavalin에 의해 유발된 수성 결핍성 안구 건조증의 토끼 모델: 눈물샘에 주입: 약물 효능 연구에 적용. J. Vis. 특급 (2020).

이 비디오에서는 토끼 모델에서 상눈물샘의 안구 부분에 Concanavalin A를 주입하여 수성 결핍성 안구 건조증을 유발하는 절차를 보여줍니다. 이 모델은 안구건조증 치료를 위한 약물의 약동학 및 생체내 분포 분석에 유용합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 동물과 주택

1. 무게가 2-3kg인 뉴질랜드 화이트(NZW) 토끼를 구입합니다.
2. 토끼는 엄격한 온도(65 ± 5°F)와 습도(45 ± 5%) 제어가 가능한 우리에 단독으로 수용합니다. 조명은 12시간 켜기/끄기 주기를 가져야 합니다.
3. 물과 표준 토끼 차우를 무제한으로 이용할 수 있습니다. 눈에 영향을 미치는 비타민 A가 포함되어 있을 수 있으므로 풍부한 식단을 피하십시오.
4. 기준선 측정 또는 안구 건조증 유도 전에 최소 2주 동안 동물을 적응시킵니다.

2. 마취 및 안락사 방법

참고: 중간 정도의 진정제가 필요한 Con A 주사를 제외한 모든 절차에는 가벼운 진정제가 필요합니다.

1. 가벼운 진정을 위해 26게이지 바늘을 사용하여 아세프로마진(1mg/kg)을 어깨에 피하로 주사합니다. 가벼운 진정 작용의 종점: 동물은 귓불이 더 이상 완전히 똑바로 서 있지 않은 상태에서 편안한 머리 자세를 유지합니다.
   메모: 적절한 종점에 도달하지 못하면 아세프로마진을 추가로 주사할 수 있습니다. 동물은 항상 깨어 있어야 하고, 수염을 만지는 것에 반응해야 하며, 호흡이 느려져서는 안 됩니다.
2. 적당한 진정을 위해 먼저 위와 같이 동물에게 아세프로마진을 투여하십시오. 종말점에 도달한 후(위 참고 사항 참조) O₂ 유량을 1L/min으로 설정하고 이소플루란 전달을 5%로 설정한 가스 마스크를 사용하여 이소플루란을 투여합니다(그림 1).
3. 토끼의 몸 긴장이 완전히 이완되고 귀가 완전히 축 늘어질 때까지 이소플루란을 투여합니다.
   메모: 동물이 옆으로 뒤집힐 때 보상적인 근육 움직임이 발생해서는 안 됩니다. 호흡은 항상 자발적으로 유지됩니다.
4. 자발적인 회복은 2-5분 이내에 발생합니다: 징후에는 자발적인 머리 움직임과 증가 또는 정상적인 근육 긴장도가 포함됩니다. 적당한 진정제로 실험 절차를 완료한 후 약 30분 동안 또는 행동이 정상으로 돌아올 때까지 토끼를 관찰합니다.
   메모: 두 형태의 진정제 중 안과 연고는 필요하지 않습니다. 1) 가벼운 진정 시에도 동물은 여전히 경계하고 눈 깜빡임 반사를 유지합니다. 중등도의 진정제에서는 눈 깜박임 반사의 억제가 너무 짧아서 안구 표면이 위험하지 않습니다. 2) 안구 표면에 안과 연고를 바르면 테스트 중에 평가된 구조를 시각화
할 수 없습니다.
5. 안락사: 펜토바르비탈 정맥 주사(100mg/kg)를 과다 투여합니다.

3. 안구건조증의 유도 및 치료

참고: 안와 눈물샘 시스템의 세 부분이 주입됩니다.

1. 토끼를 아세프로마진 0.2mg/kg으로 피하주사로 진정시킵니다.
2. 안와 주위와 두피 부위의 털을 잘라내고 Nair를 사용하여 남아 있는 털을 완전히 제거합니다. 해부학적 특징과 콘카나발린 A의 미국 유도 주사를 더 잘 시각화할 수 있도록 피부를 완전히 매끄럽게 유지합니다(그림 2).
3. 위에서 설명한 대로 적당한 진정제를 유도합니다.
4. 상눈물샘(PSLG)의 손바닥 부분 주사
   메모: PSLG를 먼저 주입합니다.
   1. 마이크로피펫으로 방부제가 없는 리도카인 25μL를 적절한 눈에 바르십시오.
   2. 윗 눈꺼풀을 절개하고 샘의 손바닥 부분을 표시하는 돌기가 보일 때까지 뒤쪽 안와 가장자리에 부드러운 내측 압력을 가합니다. PSLG는 상부 눈꺼풀의 후방(측두) 부분에서 작은 구근 높이로 나타납니다.
      메모: 학습 과정에서 분비샘 조직을 보려면 해당 부위에 5%의 플루오레세인을 바르십시오(그림 3A). 구근 PSLG에서 눈물이 흘러내리는 것을 볼 수 있습니다. 플루오레세인의 적용은 Con A의 투여에 필요하지 않습니다. 분비샘 조직을 보여주기 위한 설명 목적으로만 수행됩니다.
   3. 투베르큘린 주사기에 가는 톱니가 있는 집게와 27게이지 바늘을 사용하여 경결막 접근법을 사용하여 분비샘을 직접 관통합니다. 바늘을 조직 안으로 2mm 전진시키고 0.1mL 부피로 Con A 500μg을 주입합니다(그림 3B).
      참고: 이 주사는 때때로 고통스러울 수 있습니다. 필요한 경우이 주입이 완료 될 때까지 동물을 이소 플루란 아래에 두십시오.

결과

그림 1: 방독면 진정제. 이 사진은 이소플루란으로 짧고 적당한 진정제를 제공하는 방독면을 보여줍니다.

그림 2: 콘카나발린 A 주사를 위한 토끼의 준비. (A) 작은 가위를 사용하여 털을 제거하여 안와 상눈물샘을 식별하기 위해 랜드마크를 쉽게 시각화할 수 있습니다. (B) Nair은 전단 후 남아있는 털을 제거하는 데 사용됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
27 게이지 바늘 (5/8)	Becton Dickinson and Company, 프랭클린 레이크, 뉴저지	305921	ConA를 눈물샘에 주입하기 위한 바늘
아세프로인즈(아세프로마진)	Henry Schein Animal Health, 오하이오주 더블린	NDC11695-0079-8	토끼 진정제를 위한 0.1ml/kg 피하 주사
마취 기화기	VetEquip, 플레즌튼, CA	상품 #911103
비숍 하몬 집게	Bausch and Lomb (Storz), 브리지워터, 뉴저지	E1500-C	조직 겸자
콘카나발린 A	시그마, 세인트루이스, 미주리	2010	토끼 눈물샘에 주입하기 위해 PBS에서 5mg/ml를 만듭니다
플루오레세인	AKRON, 레이크 포레스트, 일리노이	NDC17478-253	TBU를 측정하기 위해 PBS로 0.2%로 희석
이소플루란	Henry Schein, 뉴욕주 멜빌	29405
리도카인	시그마, 세인트루이스, 미주리	L5647	마취제에 대한 PBS에서 1%
PBS(인산염 완충 식염수)	Mediatech, Inc. 버지니아주 머내서스	21-031-이력서
토끼, 뉴질랜드 화이트 또는 더치 벨트(본문에 설명된 대로)	Charles River Labs, 매사추세츠주 월섬	2-3kg	연구용 동물
수술용 확대경 +1.50	Designs for Vision, 보헤미아, 뉴욕	특산품	눈물 끊어짐을 관찰하고 Concanavalin A 주사를 실행하는 동안 안구 표면의 magnificantion를 제공하십시오.

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