돼지 대동맥 내피 세포(pAEC) 분리: 수확된 돼지 복부 대동맥에서 내피 세포를 분리하는 효소 기반 방법

초록

출처: Zhao, Y. et al. 미니어처 돼지에서 1차 대동맥 내피 세포의 분리 및 배양. J. Vis. 특급 (2019)

이 비디오에서는 1단계 콜라겐분해효소 분해를 사용하여 돼지 모델의 복부 대동맥에서 내피 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다. 내피 세포는 추가 다운스트림 적용을 위해 배양할 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 돼지 대동맥 내피 세포의 분리

1. 무균 상태에서 세척 버퍼에서 돼지 대동맥을 제거하고 150mm 페트리 접시에 놓습니다(그림 1A).
2. 대동맥의 양쪽 끝을 부드럽게 잘라내고 멸균 집게와 가위로 대동맥 주변의 여분의 조직을 다시 절제합니다(그림 1B). 20-50mL의 세척 버퍼로 대동맥의 외부와 내부(실온에서 배양 접시 위)를 세척합니다: 1%(v/v) 페니실린/스트렙토마이신.
   이 포함된 1x PBS 용액(pH 7.4) 메모: 일부 EC가 이 부위에서 손상되었기 때문에 수술 중 클램프가 삽입된 부분만 절단하고 과도한 조직과 동맥 곁가지를 제거하십시오.
3. 대동맥을 통해 외과적 봉합사를 통과시킨 다음 외과적 봉합사(5-0, 90cm, Table of Materials)를 사용하여 대동맥의 한쪽 끝을 묶습니다. 수술용 봉합사는 대동맥 내부에 두십시오(그림 1C, D).
4. 묶인 끝 부분 근처의 대동맥을 겸자로 부드럽게 고정한 다음 대동맥의 내피 표면이 노출될 때까지 수술용 봉합사를 천천히 당겨 대동맥을 역전시킵니다(그림 1E-G).
   메모: 묶인 끝 부분에 대동맥을 고정하고 대동맥을 단단히 고정하지 마십시오. 그렇지 않으면 수술 봉합사를 당겨 대동맥을 되돌릴 수 없습니다.
5. 대동맥의 내피 표면을 세척 완충액 3x(세척당 10mL)로 세척한 다음 이 용액을 버립니다. 대동맥을 15mL 원심분리 튜브에 넣고 튜브에 10mL의 0.005% 콜라겐분해효소 IV 소화액으로 대동맥을 덮습니다(그림 1H).
   메모: 소화하기 전에 0.005% 콜라겐분해효소 IV 소화액을 37°C에서 예열합니다.
6. 37°C에서 15분 동안 배양합니다. 소화된 대동맥과 소화 용액을 100mm 배양 접시에 넣고 10-15mL의 사전 냉각된 정지 완충액을 추가하여 0.005% 콜라겐분해효소 IV의 효과를 중지합니다: 10% 열 비활성화 FBS 및 1% P/S.
   가 보충된 Dulbecco의 변형된 Eagle's medium(DMEM) 메모: 권장되는 소화 시간은 10분에서 20분 사이입니다. 대동맥의 내피 표면이 정지 완충액으로 덮여 있는지 확인하십시오.
7. 세포 스크레이퍼를 사용하여 대동맥 내부 표면에서 pAEC를 부드럽게 긁어냅니다(그림 1I). 긁어낸 대동맥을 세척액(1회당 5mL)으로 3회 세척합니다. 배양 접시의 용액을 50mL 원심분리기 튜브에 넣습니다. 배양 접시 바닥을 세척 버퍼(시간당 5mL)로 2회 세척하고 용액을 다시 50mL 원심분리 튜브에 넣습니다.
   메모: 한 방향으로 부드럽게 긁어내고 압축하지 마십시오. 가장자리와 구멍 근처의 티슈를 만지지 마십시오. 5-8x 스크랩을 권장합니다.
8. 600 x g의 튜브를 4°C에서 6분 동안 원심분리합니다.상등액을 버리고 50mL 원심분리 튜브 바닥에 용액 10mL를 남겨둡니다. 50mL 원심분리 튜브에 세척 완충액 20mL를 추가하고 펠릿을 재현탁합니다. 이 단계에서 거품을 피하십시오.
9. 600 x g에서 4°C에서 6분 동안 원심분리기. 상등액을 천천히 버립니다. 세포 펠릿을 1mL의 배양 배지로 재현탁하고 잘 혼합합니다.
   메모: 얻어진 대동맥당 평균 ECs 수는 1.9 x 10°C ± 1.4 x 10°C(평균 ± SD, n = 3)입니다.
10. 셀 카운터가 있는 셀을 계산합니다. 세포 번호에 따라 어떤 물질도 코팅하지 않고 용기에 세포를 플레이트하고 배양합니다. 세포 수가 1.0 x 10° 이하인 경우 25cm² 플라스크에서 세포를 배양합니다. 세포 수가 1.0 x 10°C보다 큰 경우 25cm² 플라스크 여러 개(플라스크당 1.0 x 10°C 세포)에서 세포를 배양합니다. 플라스크를 37°C의 5% CO₂로 인큐베이터(흔들림 없이)에 넣고 2-3일마다 배지를 교체하십시오.
    메모: 일부 세포는 세포 스크레이퍼에 의해 손상됩니다. 세포 생존율 분석에서 살아있는 세포의 비율은 95.7% ± 1.7%(±평균 SD, n = 3)인 것으로 나타났습니다. 분리된 세포의 배가 시간은 약 1-2일입니다.

결과

그림 1: 돼지 대동맥 소화 및 pAEC 분리. (가) 대동맥은 차가운 세척 버퍼가 있는 150mm 페트리 접시에 넣습니다. (B) 결합 조직을 제거한 후의 돼지 대동맥 사진. (씨) 돼지 대동맥을 통과하기 위해 멸균 수술용 봉합사로 묶인 유리 막대. (디) 대동맥의 한쪽 끝은 대동맥 내부에 유지되는 멸균 수술용 봉합사로 묶여 있습니다. (

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
셀 스크레이퍼	코 닝	3010#
콜라겐분해효소 IV	시그마-알드리치	C5138#-1지
DMEM을 참조하십시오.	생명 기술	11965118#
Falcon 100mm 세포 배양 접시	코 닝	353003#
페트리 접시 (150 x 15mm)	바이오로직스그룹	66-1515년#
집게	상하이 의료 기기 유한 공사 중국
벤트 캡이 있는 직사각형 경사형 목 세포 배양 플라스크(T25)	코 닝	3289#
가위	상하이 의료 기기 유한 공사 중국
혈청학적 전사 피펫 (10ml)	JET 바이오필	GSP010010#
멸균 파스퇴르 피펫	진브릭	GY0025#
외과용 봉합사	상하이 Pudong Jinhuan 의료 용품 Co., Ltd	5-0#
20 x PBS 용액 (pH 7.4, 뉴클레아제 무함유)	(주)상곤바이오텍	B540627#
페니실린/스트렙토마이신	생명 기술	15070063#