짧은 후방 섬모 동맥 분리: 돼지 눈에서 온전한 짧은 후방 섬모 미세혈관을 절제하기 위한 프로토콜

초록

출처: Perumal, N. et al., 안구 미세혈관의 질량 분광 기반 단백질체학 분석을 위한 샘플 준비. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 돼지 눈에서 짧은 후방 섬모 동맥을 분리하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 고립된 짧은 후방 동맥은 안구 혈관의 분자적 통찰력과 단백질 프로파일을 설명하기에 적합한 출처입니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 짧은 후방 섬모 동맥의 격리

돼지 눈과 시신경 및 안구 외 조직을 검시 직후 채취했습니다. 적출된 안구는 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)에 담겨 실험실로 이송되어 즉시 사용되었습니다.

참고: 돼지의 눈은 기본적으로 전방(그림 1A)과 후방(그림 1B)으로 나뉩니다.

1. 얼음처럼 차가운 Krebs-Henseleit(K-H) 완충액이 들어 있는 해부실에 안구를 놓습니다. 날카로운 마요네즈 가위로 주변 근육과 조직을 조심스럽게 잘라냅니다.
   메모: Krebs-Henseleit(K-H) 완충액을 준비하려면 다음 화학 물질(NaCl 27.68g, NaHCO 8.4g, KCl 3,1.4g, MgSO₄ 1.18g 및 KH₂PO₄ 0.64g)을 건조하고 깨끗한 50mL 원추형 원심분리 튜브 1개에 넣고 CaCl₂ 1.47g 및 포도당 8.0g을 다른 튜브에 넣습니다. 이러한 화학 물질의 분말 혼합물은 서늘하고 건조한 곳에 보관해야 합니다. CaCl₂ 및 포도당 분말 혼합물은 수분 흡수 및 응집을 방지하기 위해 신선하게 준비하는 것이 가장 좋습니다.
2. 메스로 절개하고 눈이 앞쪽과 뒤쪽 절반으로 분리될 때까지 날카로운 마요네즈 가위로 적도면을 따라 지구를 자릅니다. 한 쌍의 표준 패턴 집게를 사용하여 눈의 뒤쪽 절반에서 가능한 한 많은 유리체를 제거합니다.
   메모: 안구를 두 부분으로 분리하면 해부 접시에서 움직이는 눈이 없어도 짧은 후부 섬모 동맥(sPCA)을 쉽게 분리할 수 있습니다. 그러나 이 단계는 필수는 아닙니다. 혈관은 또한 안구를 열지 않고도 분리할 수 있습니다.
3. 해부 핀을 사용하여 망막 쪽이 아래를 향하고 시신경이 실험자를 향하도록 눈의 뒤쪽 절반을 조심스럽게 고정합니다.
4. 시신경을 둘러싼 결합 조직을 부드럽게 잘라내어 Student Vannas 스프링 가위로 밑에 있는 후방골 혈관 구조를 노출시킵니다.
5. sPCA는 공막을 관통하고 시신경두를 둘레로 둘러싸는 혈관의 짧은 가지(5-8개 사이)로 볼 수 있습니다(그림 1C). 한 쌍의 유형 5 정밀 핀셋과 Vannas 캡슐 절개술 가위를 사용하여 paraoptic 및 distal sPCA를 주변 결합 조직과 함께 분리합니다(그림 1D).
   메모: K-H 버퍼가 분리 절차 전반에 걸쳐 얼음처럼 차갑게 유지되는지 확인합니다. 주변 온도에 따라 20-30분마다 버퍼를 교체하는 것이 좋습니다.

2. 샘플 준비

1. 실체 현미경으로 끝이 미세한 5형 정밀 핀셋과 Vannas 캡슐 절개술 가위를 사용하여 동맥 분절에서 결합 조직을 부드럽게 제거하고 얼음처럼 차가운 PBS로 분리된 동맥을 헹구어 오염 물질과 혈액 잔류물을 제거합니다.
   메모: 샘플이 다음 단계를 즉시 거치지 않으면 액체 질소에서 스냅 동결하고 나중에 사용할 때까지 -80 °C에서 보관하십시오.

결과

그림 1: 돼지 눈의 대표적인 사진.

(A) 안구의 측면은 눈의 앞쪽에 위치한 각막, 공막, 주변 근육 및 시신경을 보여줍니다. (B) 눈의 후방에서 보면 시신경이 보인다. (C) 안구 뒤쪽에서 볼 수 있는 sPCA의 분지로, paraoptic 및 distal branches로 구성되어 있습니다. (D) 주변 지방 및 결합 조직과 격리된 sPCA.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
염화칼슘 이수화물(CaCl2)	칼 로스	5239.1	2.5 밀리미터.
둘베코의 인산염 완충 식염수(PBS)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	14190169
염화나트륨 (NaCl)	칼 로스	9265.2	118.3 밀리미터
탄산수소나트륨(NaHCO3)	칼 로스	965.3	25 밀리미터미터
α-(D)-(+)- 포도당 일수화물	칼 로스	6780.1	11 밀리미터미터
일회용 메스 #21	PFM 의료	200130021
해부 핀	칼 로스	47.1 파이
엑스트라 파인 본 가위	정밀 과학 도구	14084-08
Falcon 원뿔형 원심분리기 튜브(50mL)	피셔 사이언티픽	번호 14-432-22
메이요 가위, 터프 컷	정밀 과학 도구	14130-17
정밀 핀셋	정밀 과학 도구	11251-10	유형 5
정밀 핀셋, 매우 미세한 팁이 있는 스트레이트	칼 로스	LH53.1	유형 5
표준 패턴 겸자	정밀 과학 도구	11000-12
학생 Vannas 봄 가위	정밀 과학 도구	91501-09
Vannas 캡슐 절개술 가위	게우더	19760	스트레이트, 77 mm

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