극저온 빨대를 사용한 토끼 배아 유리화: 장기 보관을 위해 토끼 배아를 보존하기 위한 초고속 냉각 기술

초록

출처: Garcia-Dominguez, X. et al. Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model. J. Vis. 특급 (2019)

이 비디오에서는 에틸렌 글리콜 및 디메틸 설폭사이드를 동결 보호제로, 극저온 빨대를 운반 시스템으로 사용하여 원하는 발달 단계에서 수확된 토끼 배아를 유리화하는 절차를 설명합니다. 유리화된 배아는 생존율이 높으며 사용할 때까지 장기간 보관할 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 배아 유리화

1. 실온(약 22°C)에서 모든 조작을 수행하여 더 따뜻한 온도에서 유리화 용액 독성을 줄입니다.
   메모: 이 프로토콜에서는 0.1–2 μL 자동 피펫을 사용하여 배아를 이동할 수 있지만, 최소 부피를 끌어당겨 배아를 이동시키는 다른 유사한 장치가 적합할 수 있습니다.
2. 2단계 첨가 절차로 배아를 유리화합니다.
   1. 기본 매체(BM)에 용해된 10%(v/v) 에틸렌 글리콜과 10%(v/v) 디메틸 설폭사이드로 구성된 평형 용액에 배아를 2분 동안 놓습니다. (BM의 조성 : Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)에 소 혈청 알부민 0.2%(w/v)가 보충됨)
   2. 배아(단계 1.2.1)를 BM에 용해된 20%(v/v) 에틸렌 글리콜과 20%(v/v) 디메틸 설폭사이드로 구성된 유리화 용액으로 1분 동안 이동합니다.
3. 배아를 0.25mL 플라스틱 미니빨대(면 마개가 있는 닫힌 쪽 끝과 열린 극한 쪽 포함)에 넣습니다. 이 프로세스는 그림 1에 도식화되어 있습니다.
   1. 0.25mL 미니스트로대의 닫힌 끝을 적절한 마이크로 디스펜서(예: Captroll III)® 와 연결합니다.
   2. 빨대 길이의 1/3까지 BM을 흡입하고 작은 기포를 흡입합니다.
   3. 40 μL의 유리화 용액에서 배아를 흡인한 후 또 다른 작은 기포를 흡입합니다.
   4. 첫 번째 액체 분획(단계 1.3.2)이 면에 도달할 때까지 BM을 흡인합니다.
   5. 빨대 플러그로 열린 끝을 닫습니다.
4. 1.3단계가 수행되는 동안 1.2.2단계를 수행하여 배아에 독성이 있는 1분 이상이 경과하지 않도록 합니다.
5. 미니빨대를 액체 질소에 직접 넣어 유리화(vitrification)를 달성합니다.
6. 원하는 시간 동안 질소를 위해 미니빨대를 듀어에 보관하십시오.

결과

그림 1: 올바르게 적재된 빨대의 도식화. A) BM은 유리화(vitrification) 과정에서 사용되는 배아 조작 배지를 말합니다. 배아는 유리화 용액에 로드되어야 합니다. B) 배아 위치의 확대된 세부 사항과 함께 적재된 빨대의 거시적 모습. 이 대용량 장치를 사용하면 최소 부피 장치와 달리 많은 수의 배아를 유리화할 수 있습니다. 또한 이 장치의 취급은 최소 볼륨 장치에 비해 더 쉽습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
소 혈청 알부민(BSA)	폭스바겐	332
디메틸 설폭 사이드	시그마 알드리치	W387509
둘베코의 인산염 완충 식염수(DPBS)	시그마 알드리치	D5773	염화칼슘 없음.
에틸렌 글리콜	시그마 알드리치	102466-남
액체 질소	에어리퀴드	P1505XXX
플라스틱 빨대 0.25 mL	IMV - 기술	6431
실체현미경	라이카	엠즈16F	몇 가지 예를 들면 Leica MZ8 또는 Nikon SMZ-10 또는 SMZ-2B와 같은 더 저렴한 옵션이 있습니다.
밀짚 플러그	IMV - 기술	6431