토끼로의 배아 이식: 배란 수혜자 암컷 토끼 모델의 난관으로 배아를 복강경 투시경 유도 이식하는 절차

초록

출처: Garcia-Dominguez, X. et al., 토끼 모델의 최적 배아 단계에서 최소 침습 배아 이식 및 배아 유리화. J. Vis. 특급 (2019)

이 비디오는 복강경을 통해 수혜자 암컷 토끼의 난관으로 배아를 이식하는 기술을 설명합니다. 그것은 산란관을 통해 이동하는 토끼의 배아 리모델링을 가능하게 하여 결국 성공적인 착상에 도움이 됩니다. 이 기술은 또한 우수한 효율성으로 저장된 배아에 사용할 수 있습니다.

프로토콜

1. 배아 이식

1. 수혜자 암컷의 준비
   1. 성적으로 성숙한 암컷(> 4.5개월)만 사용하십시오.
   2. 동부 표준시 일주일 전에 암컷을 16시간 라이트/8시 다크 체제에 적응시켜 여포 성장을 시작하고 암컷의 수용성을 향상시킵니다.
   3. 수혜자 암컷을 선택하여 외음부의 탁도와 색을 관찰합니다. 외음부가 뻣뻣하고 붉은색을 띠면 암컷은 잘 받아들입니다.
   4. 체중에 관계없이 1μg의 부세렐린 아세테이트(성선 자극 호르몬 방출 호르몬의 합성 유사체)를 1회 근육 주사하여 가성 임신(배란)을 유도합니다.
      참고: 일반적으로 0.8μg은 중형 토끼(4-5kg)의 배란 유도에 적합한 용량이므로 일반적으로 1μg이 배란을 보장합니다.
   5. 이식할 배아의 나이만큼 며칠 전에 배란을 유도합니다(예: 신선한 morula ET 70-72시간 전).
2. 마취 및 진통제
   1. 토끼의 무게를 잰 다음 마취제와 진통제를 넣으십시오.
      1. 30G 바늘이 있는 1mL 주사기에 자일라진(5mg/kg)과 부프레노르핀 염산염(0.03mg/kg)을 로드합니다. 23G 두개주위 바늘이 있는 다른 1mL 주사기에 케타민 하이드로클로라이드(35mg/kg)를 로드합니다.
   2. 토끼를 잡고 자일라진-부프레노르핀 혼합물을 근육 주사합니다.
   3. 케타민이 든 두개주위 바늘을 가장자리 귀 정맥에 삽입하고 모든 주사기 내용물을 천천히 정맥 주사합니다.
   4. 바늘을 고정하고 필요한 경우 더 많은 마취를 시행하기 위해 나머지 단계 동안 바늘을 삽입한 상태로 두십시오.
   5. 토끼를 따뜻한 무대에서 새장(깨끗하고 다른 동물이 없음)에 두십시오.
   6. 의식을 잃으면 안구 건조를 피하기 위해 안구연고를 바르고 안구 반사가 없는지 확인합니다.
      메모: 이 프로토콜은 최소 30분 동안 외과적 마취 평면을 제공합니다. 더 긴 시간이 필요한 경우 30분 후 1.2.1에 설명된 케타민 염산염 양의 절반을 추가 용량으로 주입하십시오.
   7. 페달 반사와 호흡 움직임을 확인하여 마취 깊이를 모니터링합니다. 호흡 패턴이 불규칙하고 빠른 속도로 변화하는 것은 적절한 마취 평면의 상실을 나타냅니다.
   8. 점막(눈, 입술 등), 호흡수(분당 30-60회), 심박수(분당 120-325회) 및 직장 온도(38-39.6°C)의 색상을 모니터링합니다.
   9. 이송 8시간 전에는 ET 과정이 완료될 때까지 더 큰 소화관 크기와 활동을 피하기 위해 동물의 음식을 섭취하지 마십시오. 물을 자유롭게 이용할 수 있습니다.
3. 배아 준비
   1. 배아 조작 배지를 25°C로 예열합니다: Dulbecco의 DPBS(Phosphate-Buffered Saline)에 0.2%(w/v)의 소 혈청 알부민이 보충된 기본 배지(BM).
   2. 실체 현미경으로 작업하면서 신선하거나 해동된(2단계) 배아를 BM으로 헹굽니다.
   3. 멸균 장갑을 사용하여 적절하게 구성된 17G 경막외 카테터를 1mL 주사기에 부착합니다.
   4. BM 1cm를 카테터에 흡입한 다음 작은 기포를 흡입합니다.
   5. 10μL의 BM 부피에서 5-7개의 배아를 흡인한 다음 또 다른 작은 기포를 흡입합니다.
   6. BM 1cm를 흡인하여 카테터 장착을 마칩니다.
4. 배아 이식
   1. 무균 환경을 보장하기 위해 멸균 장갑, 가운 및 마스크의 사용을 고려하십시오.
   2. 수술 기구를 살균하고, 수술을 할 표면을 청소하고, 70% 에탄올로 닦습니다.
   3. 앞서 자세히 설명한 대로 마취를 수행하고(1.2단계) 반사 상실을 확인합니다.
   4. 전기 면도기로 복
   부 복부의 털을 면도하십시오.
   5. 복부 복부를 무균으로 준비합니다.
      1. 수술 부위를 청소하고 남아 있는 머리카락을 제거합니다. 클로르헥시딘 글루코네이트 비누로 수술 부위를 씻습니다. 클로르헥시딘 용액과 에탄올 96º(3회)로 해당 부위를 소독합니다.
   6. 따뜻한 수술대에 동물을 올려 놓고 트렌델렌버그의 자세(머리를 45°로 숙임)로 하여 위와 장이 두개골 위치에 있는지 확인합니다. 방광이 울퉁불퉁한 경우 방광을 배출하는 것을 고려하십시오. 이 과정에서 내장이 손상되면 동물이 죽을 수 있습니다. 따라서 올바른 위치에 두는 것이 중요합니다(그림 1).
   7. 멸균 수건으로 해당 부위를 덮고 면도한 부위를 노출시키는 구멍(창공)을 뚫어 수술 부위를 잠재적인 오염 부위와 분리합니다.
   8. 복강에 5cm, 꼬리 쪽으로 2cm의 내시경 투관침 하나를 삽입하고 압력을 조절하는 기계적 주입기로 복막강을 통해 팽창시킵니다.
      메모: 복강 내 압력은 CO₂와 함께 8-12mmHg여야 합니다(그림 1A).
   9. 내시경 투관침을 통해 내시경 카메라를 삽입합니다(그림 1B).
      참고: 생식관을 식별하고 ET 전에 안저와 앰풀라의 상태와 위치를 결정하여 다음 단계를 용이하게 합니다.
   10. 17-G 경막외 바늘을 안저에서 2-3cm 떨어진 서혜부 부위에 삽입합니다(그림 1B).
   11. 안저의 입구를 확인합니다(그림 2A, 2B).
   12. 장전된 카테터(1.3단계)를 경막외 바늘을 통해 복부에 삽입합니다(그림 1C).
   13. 난관을 찾아 앰풀라의 안저를 통해 경막외 카테터의 1-2cm를 삽입합니다(그림 2A-2C). 손상과 출혈을 방지하기 위해 난관으로 너무 멀리 진행하지 마십시오.
   14. 카테터에 연결된 주사기의 플런저를 부드럽게 눌러 배아를 난관으로 방출합니다(그림 2D-2F). 두 기포가 모두 카테터에서 나와야 합니다.
   15. 배아가 방출된 직후 카테터를 제거합니다.
   16. 카테터를 헹구고 조작 매체를 흡인 및 방출하여 배아의 부재를 확인하고 성공적인 이식을 확인합니다.
   17. 원하는 경우 자궁의 다른 쪽에서 1.4.11-1.4.16단계를 반복합니다.
   18. 경막외 바늘과 내시경 카메라를 제거합니다.
   19. 내시경 투관침을 통해 CO₂를 방출합니다. 동물의 복부에 과도한 가스가 남아 있으면 통증과 불편함이 있습니다.
   20. 복강에서 내시경 투관침을 제거합니다. 수술용 수건을 제거합니다.
   21. 마취를 중단하십시오.
   22. 투관침으로 절개한 부위를 클로르헥시딘 용액으로 세척합니다. 투관침으로 만든 절개 부위를 미분화 알루미늄과 플라스틱 드레싱으로 봉합합니다.

결과

그림 1: 복강경으로 보조되는 복강경 배아 이식(외부 보기).A) 내시경 투관침(1개 포트) 삽입. B) 내시경 카메라 및 경막외 바늘(검은색 화살표) 삽입. C) 경막외 바늘을 통한 배아 이식 카테터(흰색 화살표) 삽입.

그림 2: 복강경으로 보조되는 복강경 배아 이식(내부 보기).A: 경막외 바늘을 통해 카테터를 복부에 삽입합니다. 별표는...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
소 혈청 알부민(BSA)	폭스바겐	332
부프레노르핀 염산염	Alvet Escartí	626	면허가 있는 수의사의 지시를 받아야 합니다.
Buserelin 아세테이트	시그마 알드리치	나3303
이산화탄소(CO2	에어리퀴드	99921	이산화탄소2 N48.
둘베코의 인산염 완충 식염수(DPBS)	시그마 알드리치	D5773	염화칼슘 없음
전기 면도기	오스터 골든 A5	TEL: 078005-140-002
내시경 카메라	Optomic Spain S.A	OP-714
실리콘 리플릿 밸브가 있는 내시경 투관침	칼 스토츠(Karl Storz) 내시경 이베리카 S.A.	30114GK	경량 투관침 모델.
클로르헥시딘 디글루코네이트 비누	Alvet Escartí	0265DCCJ500B
두개바늘 23G	Alvet Escartí	514056353	더 작은 바늘도 사용할 수 있습니다.
경막외 카테터	Vygon 기업	187.1
경막외 주사 바늘	Vygon 기업	187.1
눈 연고	Alvet Escartí	5273
복강경 장비	칼 스토츠(Karl Storz) 내시경 이베리카 S.A.	26003 AA 시리즈	홉킨스® 복강경, 0º-mm 직선 관찰 복강경, 길이 30cm, 5mm 작동 채널.
광원	Optomic Spain S.A	피브로룩스 250
기계식 CO2 인플루플랜터	칼 스토츠(Karl Storz) 내시경 이베리카 S.A.	엔도플래터®
인서플라토용 실리콘 튜브	r Karl Storz 내시경 Ibérica S.A.	20400040
실체현미경	라이카	엠즈16F	몇 가지 예를 들면 Leica MZ8 또는 Nikon SMZ-10 또는 SMZ-2B와 같은 더 저렴한 옵션이 있습니다.
토끼	발렌시아 폴리테크니카 대학교(Universitat Politècnica de València)	라인 A	Line V 또는 Line HP와 같은 다른 모계 라인을 사용할 수 있습니다.