짧은 헤어핀 RNA 매개 유전자 knockdown in iHSPCs In vitro: 특정 유전자 발현의 Knockdown을 위해 iHSPC에 렌티바이러스 기반 shRNA 발현 시스템 전달

초록

출처: Hsiao, Y. L., et al. 조혈 줄기 및 전구 세포주에서 짧은 헤어핀 RNA 매개 유전자 녹다운에 의한 수지상 세포 발달 연구. J. Vis. 특급 (2022).

이 동영상에서는 shRNA 렌티바이러스 벡터의 transduction을 수행하여 immortalized hematopoietic stem and progenitor cells (iHSPCs)에서 안정적인 knockdown cell line을 얻는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

1. 불멸화 조혈 줄기 및 전구 세포주(iHSPC)의 준비

1. 100ng/mL FL 및 1μM β-에스트라디올을 함유하는 완전한 RPMI 1640 배지에서 iHSPC 세포주를 유지합니다.
2. 3일마다 1:10의 비율로 세포를 계대에 계대시킵니다.
   메모: 10% 소 태아 혈청(FBS), 5 ^x10-5 M β-메르캅토에탄올 및 10 μg/mL 겐타마이신을 보충하여 완전한 RPMI 1640 배지를 만드십시오. 재조합 murine FL도 상업적으로 이용 가능합니다.

2. 렌티바이러스 형질주입

1. 100ng/mL FL, 1μM β-에스트라디올 및 8μg/mL 폴리브레네를 포함하는 완전한 배지 1mL의 12웰 플레이트에 있는 1 x 10⁵개 세포/웰 밀도의 iHSPC.
   메모: 폴리브레렌의 농도는 세포 유형에 따라 다르며 일반적으로 4-8μg/mL 범위입니다.
2. 100.
   의 감염 다중성(MOI)으로 각 웰에 shRNA 운반 렌티바이러스를 추가합니다. 메모: 렌티바이러스 벡터는 퓨로마이신 선택 마커가 있는 pLKO.1-Puro입니다(그림 1). LacZ, Tcf4, Id2에 대한 shRNA의 타겟 염기서열은 Table of Materials에 나열되어 있습니다. MOI는 감염 중에 세포당 추가되는 비리온의 수로 정의됩니다.
   
3. 1,100 x g에서 37°C에서 90분 동안 플레이트를 회전시킵니다.
4. 감염된 세포가 들어있는 플레이트를 인큐베이터에서 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
   메모: 세포가 폴리브레네에 민감한 경우 스핀 감염 후 폴리브레렌이 없는 완전한 배지로 세포를 새로 고칩니다.
5. 감염 후 24시간 후에 100ng/mL FL 및 1μM β-에스트라디올을 함유한 완전한 배지로 세포를 재생합니다.
6. 6μg/mL의 퓨로마이신을 배지에 첨가하여 추가 24h.
   후 감염된 세포를 선택합니다. 메모: transduced lentiviral vector는 일반적으로 puromycin 저항성 유전자를 포함한 유전자를 발현하는 데 48시간이 걸립니다. 퓨로마이신의 농도가 각 세포주에 최적화되어 있는지 확인합니다.
7. 100ng/mL FL, 1μM β-에스트라디올 및 6μg/mL 퓨로마이신을 함유한 선별 배지를 3일마다 새로 고치고 안정적으로 형질도입된 iHSPC 세포를 확장하기 위해 최소 1주일 동안 세포를 유지합니다.
   메모: 퓨로마이신 선택은 일반적으로 48시간 후에 적용되며, 선택 기간은 세포 유형에 따라 다릅니다.

결과

그림 1: 렌티바이러스 벡터 pLKO.1-Puro의 구성.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1.5 mL 마이크로 튜브	엑스트라진	튜브-170-C
12웰 조직 배양 처리된 플레이트	송골매	353043
소 태아 혈청(FBS)	코 닝	35-010-이력서
RPMI 1640 배지	지브코	11875-085
β-에스트라디올	시그마-알드리치	E2758-250MG
β-메르캅토에탄올(β-ME)	시그마-알드리치	M6250
Flt3 리간드(FL)	집에서 만든
폴리브레네	시그마-알드리치	TR-1003-G
푸로마이신	인비보젠	개미-PR-1
shId2 (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390)	RNAi 컨소시엄(TRC)
shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224)	RNAi 컨소시엄(TRC)
shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094)	RNAi 컨소시엄(TRC)

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