All-in-one CRISPR 게놈 편집: CRISPR-Cas9 시스템을 사용하여 배양된 세포에서 상동성 유도 복구 기반 유전자 knock-in 방법

초록

출처: Zhang, L. et al, Gene Knock-in CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines. J. Vis. 특급. (2021).

이 비디오에서는 Cas9 및 sgRNA가 세포에 단일 플라스미드 구조로 제공되는 배양 세포에서 올인원 CRISPR-Cas9 기반 게놈 편집을 시연합니다. CRISPR-Cas9 시스템과 삽입하고자 하는 유전자는 전기천공법을 통해 세포에 도입되어 성공적인 유전자 편집을 가능하게 했습니다.

프로토콜

1. 대식세포와 T 세포주의 전기천공법

1. 전기천공을 위한 세포 배양 준비
   1. Jurkat T 세포의 완전한 성장 배지로 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640을 준비합니다. RAW264.7 대식세포 배양을 위해 10% FBS가 포함된 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)을 준비합니다. 세포 분류 전 transfection 배양에 사용되는 배지를 제외하고 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신(Pen/Strep)으로 모든 전체 성장 배지를 보충합니다.
   2. 공급업체의 지침에 따라 RAW264.7 및 Jurkat T 세포의 계대배양을 수행합니다(재료 표 참조). RAW264.7 세포를 외대배양할 때 트립신-EDTA 용액(0.25%)을 사용하여 세포를 분리합니다. 10%(v/v) DMSO가 보충된 FBS를 RAW264.7 및 Jurkat 세포의 동결 보존 배지로 사용합니다.
   3. RAW264.7 대식세포의 경우 250 × g에서 5분 동안 세포를 수집하고, Jurkat T 세포의 경우 90 × g에서 8분 동안 세포를 수집합니다. 그런 다음 5-10mL의 1× DPBS(Ca²⁺ 또는 Mg²⁺ 이온 제외)로 세척합니다. DPBS를 제거합니다.
   4. 1× DPBS 2mL를 사용하여 세포 펠렛을 재현탁합니다. 10μL의 세포를 사용하고 동일한 부피의 0.2% 트리판 블루와 혼합하여 세포 수와 생존율을 추정합니다.
      메모: transfection 당일 세포 배양이 >90%의 생존율을 갖도록 합니다.
   5. 단일 knock-in 실험의 경우 10μL 핵 절제 팁으로 5회 반복하여 전기천공을 수행합니다. 2.0 × 106 세포에 필요한 부피를 계산하고 원심분리를 통해 세포를 펠릿화합니다. 1.1.2.
      단계에 설명된 대로 1× DPBS로 셀 펠릿을 다시 세척합니다. 메모: 10μL nucleofection tip을 사용할 때 전기천공당 4.0 × 10⁵개의 세포가 필요합니다. 따라서, 1회의 knock-in 실험을 위해 최소 2.0 × 10⁶개의 세포를 준비합니다.
   6. Pen/Strep 없이 웰당 0.5mL의 완전한 성장 배지(1.1.1단계에서 준비)가 있는 24웰 플레이트를 준비하고 37°C 인큐베이터에서 예열합니다.

2. CRISPR/Cas9 성분 및 표적화 벡터의 전기천공법

1. electroporation 시스템을 켭니다. RAW264.7 대식세포의 경우 1,400V/20ms/2펄스, Jurkat T 세포의 경우 1350V/20ms/2펄스와 같이 최적화된 전기천공법 매개변수를 사용합니다.
2. 피펫팅으로 인한 시료 손실을 고려하여 각 CRISPR/Cas9 벡터 2.5μg(mRosa26 유전자 좌위 knock-in의 경우 pDsR-mR26-sg1 및 pDsR-mR26-sg2, hROSA26 유전자 자리의 경우 pDsR-hR26-sg1 및 pDsR-hR26-sg2), 선형화된 표적화 벡터(mRosa26 및 hROSA26의 경우 pKR26-POI-iBFP 또는 pKhR26-p-iBFP) 2.4μg을 포함하는 멸균 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 55μL 전기천공법 혼합물을 준비합니다.EcoRI 또는 BamHI에 의해 선형화된 knock-in) 및 Resuspension Buffer R.
   메모: 시간을 절약하기 위해 원심분리 중에 전기천공법 혼합물을 준비할 수 있습니다(단계 1.1.5).
3. 1.2.2× 55μL 전기천공법 혼합물에 2.0⁶개 세포(1.1.5단계에서 준비)를 재현탁합니다.
4. 피펫이 있는 10μL 핵 펙션 팁을 사용하여 1.2.3단계의 세포/전기천공법 혼합물을 흡입합니다.
   메모: 피펫팅 중에는 전기천공법 실패를 유발할 수 있는 기포가 유입되지 않도록 하십시오.
5. electroporation kit의 Buffer E 3 mL로 채워진 튜브에 샘플을 추가합니다.
6. 1.2.1단계에서 설명한 대로 두 세포 유형에 대한 electroporation 매개변수를 적용합니다.
7. 1.1.6단계에서 예열된 매체가 있는 24웰 플레이트의 한 웰로 샘플을 옮깁니다.
8. 다른 네 번의 반복과 표적화 벡터만 및 CRISPR 발현 벡터만 control.
   에 대해 1.2.4-1.2.7 단계를 반복합니다. 메모: 다른 세포 유형/플라스미드 DNA로 전환할 때 nucleofection tip과 tube를 변경합니다.
9. 형질주입된 세포를 48-72시간 동안 배양하여 전기천공 후 회수하고 유세포 분석 또는 형광 활성화 세포 분류(FACS) 전에 CRISPR/Cas9 성분이 발현될 수 있도록 합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
암피실린, 나트륨 염	MP 바이오메디컬	194526
Cellometer 미니 자동 세포 계수기	Nexcelom 생명과학
DPBS (10X), 칼슘 없음, 마그네슘 없음	써모피셔 사이언티픽	14200075
Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle Medium) 고포도	하이클론	SH30022.01
Falcon 5ml 폴리스티렌 원형 바닥 시험관	BD 바이오사이언스	352003
소 태아 혈청(FBS)	써모피셔 사이언티픽	10099141
주르캣	증권 시세	TIB-152	https://www.atcc.org/
카나마이신 설페이트	MP 바이오메디컬	194531
멀티채널 피펫(30-300 μL)	Eppendorf 또는 동급 차량
Neon Transfection 시스템	써모피셔 사이언티픽	MPK5000
Neon Transfection 시스템, 10 μL 키트	써모피셔 사이언티픽	MPK1096
Nunc 15 mL 원뿔형 멸균 원심분리기 튜브	써모피셔 사이언티픽	339651
피펫 팁 0.1-20μl	Eppendorf 또는 동급 차량	제0030호 제075.005
피펫 팁 2-200μl	Eppendorf 또는 동급 차량	0030 075.021
피펫 팁 50-1000μl	Eppendorf 또는 동급 차량	제0030호 제075.064
pX458-DsRed2	애드진	112219
라우264.7	증권 시세	TIB-71	https://www.atcc.org/
RPMI 1640 미디엄	하이클론	SH30027.01
페니실린-스트렙토마이신	써모피셔 사이언티픽	15140122
트리판 블루 솔루션, 0.4%	써모피셔 사이언티픽	15250061
1.5 mL 마이크로튜브, PCR-clean	Eppendorf 또는 동급 차량	0030 125.215
24웰 투명 TC 처리된 다중 웰 플레이트	코 닝	3524

당 표시기 - 무수정유출 호 호 표시기 년