Zinc Finger Nuclease-based genome editing: double-stranded homology dependent repair mechanism에 의한 인간 만능 줄기세포의 게놈 수정 기법

초록

출처: Blair, J. D., et al. 게놈 편집 인간 만능 줄기 세포주 구축: 표적화에서 분리까지. J. Vis. 특급 (2016).

이 동영상은 인간 만능 줄기세포(hPSC)에서 아연-핑거 뉴클레아제 기반 게놈 편집 기술을 보여줍니다. hPSC는 잠재적으로 다양한 세포 유형으로 분화될 수 있기 때문에 이 기술은 환자 맞춤형 방식으로 체외 병리학 및 약리학 연구에 도움이 됩니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 편집을 위한 줄기세포 준비

1. 젤라틴에서 자란 미토마이신 C-불활성화 마우스 배아 섬유아세포(MEF) 공급기의 2.4 × 10⁶ 세포/플레이트를 포함하는 6웰 플레이트에서 인간 만능 줄기세포(hPSC)를 성장시키고 배양합니다. 웰당 3ml의 인간 배아 줄기 세포 배지(hESC 배지)에서 hPSC를 유지하고 3% O₂/5% CO₂.
   로 37°C 인큐베이터에서 성장합니다. 메모: 이 프로토콜의 성공을 위해 저산소 인큐베이터에서 hPSC를 유지할 필요는 없습니다. 그러나 hPSC는 높은 O₂ 환경에서 더 빨리 증식하므로 그에 따라 시간과 세포 수를 조정해야 한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 또한 저산소에서 유지되는 hPSC는 자발적 분화 속도가 낮다는 점에 유의해야 합니다.
   1. 500ml hESC 배지를 만들려면 380ml DMEM/F12, 75ml 소 태아 세럼(FBS), 25ml 녹아웃 세럼 대체품(KSR)을 결합하십시오. 글루타민(1mM 최종 농도), 5ml 100x 비필수 아미노산, 100단위/ml 페니실린-스트렙토마이신(P/S), 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)(4ng/ml 최종 농도) 및 2-메르캅토에탄올(5.5μM 최종 농도)을 추가합니다.
2. 유리 피펫과 진공 청소기를 사용하여 전체 미디어 용량(3ml)을 제거하여 미디어를 교체합니다. 혈청학적 피펫을 사용하여 3ml의 따뜻한 hESC 배지로 교체합니다. hPSC가 약 50% 융합될 때까지(Day-1) 매일 배지 교체를 반복합니다.
3. 표적화하기 하루 전(Day-1)에 hESC 배지를 변경하여 기존 배지를 제거하고 10μM Y-27632가 보충된 따뜻한 hESC 배지를 추가합니다.
4. 또한 -1일차에 DR4 마우스(2.4 × 10⁶ 세포/플레이트)에서 약물 내성 MEF 공급 세포 1-2개를 준비합니다.
   참고: 일반적으로 6웰 플레이트는 더 많은 매체를 수용하기 때문에 10cm 플레이트보다 유리합니다. 6개의 웰 플레이트는 또한 서로 다른 웰의 서로 다른 클론이 독립적임을 보장합니다. 그러나 10cm 플레이트를 사용하면 이 프로세스에 사용할 수 있는 현미경에 따라 더 쉽게 선택할 수 있습니다.

2. 만능 줄기세포 편집

1. ZFN 1 및 2(그림 1)를 각각 5μg씩 1.5ml 튜브에 피펫팅하여 transfection 용액을 준비합니다. 이 튜브에도 30 μg의 수리 플라스미드를 피펫팅합니다. 마지막으로, 1x Phosphate Buffered Saline(PBS)을 튜브에 피펫팅하여 부피를 최대 300μl.
   까지 가져옵니다. 메모: transfection 용액의 총 부피를 300 μl 미만으로 유지하기 위해 최소 농도가 300 ng/μl인 midiprep(모든 키트가 적합함)으로 플라스미드를 준비합니다. 페놀/클로로포름 추출을 수행하거나, 플라스미드를 선형화하거나, 내독소가 없는 플라스미드 준비 키트를 사용할 필요가 없습니다.
2. 유리 피펫과 진공 청소기를 사용하여 hPSC에서 배지를 제거합니다. 피펫 2ml는 세포를 씻기 위해 각 웰에 1x PBS를 데웁니다.
3. 유리 피펫과 진공 청소기를 사용하여 PBS를 즉시 제거하십시오. 0.5ml 0.25% 트립신-EDTA 용액을 각 웰의 세포에 직접 첨가합니다. 인큐베이터(37°C/5% CO₂/3% O₂)에 약 10분 동안 또는 피더 층이 플레이트에서 들어 올려지기 시작할 때까지 놓습니다.
4. 트립신 반응을 멈추기 위해 각 웰에 2ml의 따뜻한 esWash 매체(470ml DMEM/F12, 25ml FBS, 100단위/ml P/S)를 추가합니다.
5. 피더 셀이 시트로 분리되는지 확인합니다. 각 웰의 내용물을 단일 50ml 원뿔형 튜브에 피펫으로 넣고 모든 웰을 결합합니다. 10ml 혈청학적 피펫을 사용하여 세포를 분쇄합니다. 피더 층을 분해할 필요는 없습니다. hPSC는 부드러운 분쇄에 의해 피더 층에서 떨어져 나옵니다. 약 15ml의 세포 현탁액이 있어야 합니다.
6. 튜브에 25ml의 esWash 매체를 추가하여 총 40ml까지 용량을 가져옵니다. 큰 피더 덩어리가 1-2분 동안 튜브 바닥에 가라앉도록 합니다. 혈청학적 피펫을 사용하여 튜브에서 상등액(~38ml)을 제거하고 새 50ml 원뿔형 튜브에 넣습니다.
7. 190 x g에서 5분 동안 스핀다운합니다. 유리 피펫과 진공 청소기를 사용하여 튜브에서 상층액을 제거합니다. 세포 펠릿을 방해하지 마십시오. 500μl 1x PBS에서 세포를 재현탁합니다. 이전에 준비된 플라스미드 transfection 용액과 결합하십시오. 이 단계에서 셀 수를 셉니다. electroporation당 5-1,000만 개의 세포를 사용합니다.
8. 전체 800 μl 현탁액을 4mm 전기천공법 큐벳에 피펫으로 넣고 250 V, 500 μF, ∞ 저항 및 4 mm 큐벳 크기의 매개변수와 함께 전기천공법 시스템의 지수 프로그램을 사용하여 3-5분 동안 얼음 위에 놓습니다. 전기천공법 후 큐벳을 다시 얼음 위에 올려 3분 동안 놓습니다.
   메모: electroporation 시스템에서 electroporation의 시간 상수를 관찰합니다. 시간 상수는 세포 수와 DNA 순도에 따라 다릅니다. 성공적인 transfection은 나열된 조건과 gene pulser II를 사용할 때 일반적으로 10-14 msec 사이의 시간 상수를 갖습니다. 낮은 electroporation 효율은 시간 상수가 이러한 값에서 달라질 때 발생할 수 있습니다.
9. 10μM Y-27632가 보충된 18ml 따뜻한 hESC 배지에 전기천공된 세포를 재현탁합니다. 이 단일 세포 현탁액의 3ml를 DR4 공급기 셀이 있는 6웰 플레이트의 각 웰에 플레이트합니다. 인큐베이터로 돌아갑니다(37°C/5% CO₂/3% O₂).

3. 포지티브 콜로니의 선택

1. 2일차, 유리 피펫과 진공 청소기를 사용하여 모든 매체를 제거합니다. 10μM Y-27632가 보충된 따뜻한 hESC 배지 3ml로 교체합니다. 3일차, 유리 피펫과 진공 청소기를 사용하여 모든 매체를 제거합니다. Y-3은 포함하지 않고 27632ml의 따뜻한 hESC 매체로 교체하십시오. 4일차, 유리 피펫과 진공 청소기를 사용하여 모든 매체를 제거합니다. 항생제가 보충된 3ml의 따뜻한 hESC 배지로 교체하여 선택합니다. 인큐베이터로 돌아가기(37°C/5% CO₂/3% O₂).
   메모: 사용되는 항생제의 유형은 복구 템플릿에 포함된 내성 카세트에 따라 다릅니다. WIBR#3 hPSC(NIH 레지스트리 0079)로 작업할 때 0.5μg/ml 퓨로마이신, 70μg/ml G418(게네티신) 및 35μg/ml 하이그로마이신이 성공적으로 사용되었습니다. 선택을 위한 농도는 약 1주일 이내에 야생형 세포를 죽이는 데 필요한 항생제의 최소 농도를 설정하여 경험적으로 결정해야 합니다.
2. 5-12일차에는 매일 배지를 교체하고 매번 오래된 배지를 항생제가 첨가된 따뜻한 hESC 배지로 교체합니다.
   메모: 많은 양의 세포 사멸을 예상합니다. 개별 군체는 8-10일경에 분명해집니다. 항생제를 사용하지 않는 일반 hESC 배지는 12-14일 동안 지속적으로 선택한 후에 사용할 수 있습니다. 세포 밀도가 높거나 세포 사멸이 느린 경우 배지의 산성화를 피해야 하며 선택 후 처음 며칠 동안 배지 부피(최대 4-5ml)를 늘려야 할 수 있습니다.

결과

그림 1. AAV-CAGGS-EGFP 복구 템플릿을 사용하여 유전자 편집된 AAVS1 유전자 자리의 개략도. Hockemeyer et al., 2009에서 수정됨.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM/F12	생명 기술	11320082
소 태아 세럼 (HI)	생명 기술	제10082-147
녹아웃 세럼	생명 기술	제10828-028
섬유아세포 성장 인자 - 기본	생명 기술	PHG0261
펜/연쇄상구균	생명 기술	15140-122
글루타민	생명 기술	제25030-081
MEM NEAA	생명 기술	제11140-050
2-메르캅토에탄올	생명 기술	21985-023
Y-27632	칼바이오켐	688000
6웰 플레이트	코 닝	3506
4mm Electroporation 큐벳	바이오 라드	165-2081
X-cel 유전자 펄서 II	바이오 라드	165-2661
0.25% 트립신-EDTA	생명 기술	제25200-056
10× 인산염 완충 식염수(PBS) pH7.4	생명 기술	70011-044
푸로마이신	생명 기술	A11138-02