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1. Basement Membrane Matrix 준비 및 플라스틱 용기 코팅
- -20°C의 얼어붙은 기저막 매트릭스 스톡을 얼음 위에 놓고 4°C에서 밤새 해동합니다.
- 해동 후, 기저막 매트릭스의 분취액 2mg을 미리 냉각된 에펜도르프 튜브에 피펫으로 넣습니다. 필요할 때까지 -20 °C에서 보관하십시오.
- 기저막 매트릭스 코팅 플레이트를 준비하려면 eppendorf tube의 마지막 얼음 조각이 사라질 때까지(보통 ~2시간 이내) 얼음 위에서 부분 표본 하나를 해동합니다.
- 해동 후 12ml의 차갑은(4°C) DMEM/F12에 기저막 매트릭스를 첨가하여 기저막 매트릭스 코팅 용액을 만듭니다.
- 기저막 매트릭스 용액을 적절한 배양 용기에 추가합니다. 6웰 플레이트의 경우 웰당 1ml를 분배합니다. 플레이트를 소용돌이쳐 기저막 매트릭스 용액이 각 웰을 완전히 덮도록 합니다.
- 파라필름은 기저막 매트릭스 코팅된 플레이트/접시를 밀봉하고 사용하기 전에 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 또는 기저막 매트릭스 코팅 플레이트/접시를 4°C에서 보관하고 코팅 후 2주 이내에 사용하십시오.
메모: 건조를 방지하기 위해 기저막 매트릭스 코팅 플레이트/접시에 DMEM/F12를 추가로 추가합니다. 4°C에 보관된 기저막 매트릭스 코팅 플레이트/접시를 사용하기 전에 생물 안전 캐비닛에 넣고 최소 30분 동안 실온에 두십시오.
- 배지와 세포를 추가하기 전에 기저막 매트릭스를 완전히 흡인합니다.
2. E8 매체 준비
- E8 보충제를 4°C에서 밤새 해동하여 E8 배양 배지를 준비합니다.
- 500ml 스톡에서 E8 기초 배지 10ml를 제거하고 버립니다.
- E8 보충제 10ml 바이알 전체를 490ml의 E8 기초 배지에 직접 피펫팅합니다. 반복적인 온도 변화로 인해 전체 E8 배지의 bFGF가 저하될 수 있으므로 37°C 수조에서 전체 E8 배지를 가열하지 마십시오.
- 보충제 추가 후 2주 이내에 완전한 E8 배지를 사용하십시오.
3. iPSC의 해동
- 액체 질소에서 얼린 iPSC 바이알을 꺼내 드라이아이스에 넣습니다.
- 37°C의 수조에서 바이알을 빠르게 해동하고, 작은 얼음 조각만 남을 때까지 수조에서 바이알을 휘젓습니다.
- 바이알에 70% 에탄올을 분사하고 생물 안전 캐비닛으로 옮깁니다.
- 실온 E8 매체 1ml를 바이알에 직접 적가합니다.
- 2ml 피펫을 사용하여 15ml 원뿔형 튜브에 있는 9ml의 E8 배지에 세포 현탁액을 적반합니다. 세포와 배지가 빠르게 잘 혼합되도록 튜브를 자주 휘젓습니다.
- 200 x g에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다.
- 상층액을 흡인하고 10μM Y-27632가 보충된 적절한 양의 E8로 세포 펠릿을 재현탁합니다.
- 적절한 수의 기저막 매트릭스 코팅 웰에 세포를 추가하고 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 하룻밤 동안 놓습니다. 해동 후 빠른 회복을 위해 6웰 플레이트의 웰당 최소 0.2 x 10⁶ iPSC를 플레이트링하는 것이 좋습니다.
4. iPSC의 유지 관리 및 일상적인 계류
- E8 매체를 매일 교체하십시오.
- 도립 현미경으로 세포의 형태와 밀도를 모니터링하십시오. 고품질의 iPSC는 뚜렷한 경계가 있는 평평한 군체에서 성장합니다. 개별 군체는 "조약돌 같은" 모양을 가지고 있습니다.
- iPSC 세포가 ~70% 포화도에 도달할 때 통과시킵니다.
- 500ml DPBS에 0.9g NaCl 및 500μl 0.5M EDTA를 첨가하여 EDTA 계대 살균 용액을 준비합니다. NaCl을 잘 섞어 녹이고 진공 필터를 섞어 살균합니다. 전달하기 전에 37°C 수조에서 전달액의 부분 표본을 데웁니다.
- 통과시키려면, 사용한 배양 배지를 흡인하고 동일한 부피의 따뜻한 패시징 용액으로 세포를 한 번 세척합니다. 세포를 코팅하기에 충분한 EDTA 계대 살균 용액을 흡인하고 피펫팅합니다(6웰 플레이트의 웰당 1ml).
- 세포를 도립 현미경 아래에 놓고 iPSC 집락을 관찰합니다. 군체와 융기된 국경 내에 구멍이 생기는 것은 2-5분 이내에 분명해집니다.
- EDTA 패시징 용액을 조심스럽게 흡입하십시오.
- 10ml 피펫을 사용하여 4ml의 E8 배지(6웰 플레이트를 사용하는 경우)를 고압으로 배분할 각 웰에 직접 분배합니다.
- iPSC 덩어리를 모아 1:8에서 1:12 사이의 분할 비율에 따라 적절한 수의 웰로 분할합니다. 세포 덩어리의 분리는 생존력을 떨어뜨릴 수 있으므로 과도하게 피펫팅하지 마십시오.
- 플레이트를 인큐베이터에 넣고 플레이트를 앞뒤로, 좌우로 여러 번 흔들어 세포를 분산시킵니다.
5. Transfection을 위한 MEF 및 iPSC 준비
- transfection 48시간 전, iPSC를 ~1:6으로 기저 멤브레인 매트릭스로 코팅된 6-well plate의 4개 이상의 well로 통과시켜 2일 후에 70% 융합되도록 합니다.
- 다음 날, DR4 MEF를 10% FBS와 1x MEM-NEAA가 보충된 DMEM(고포도당)으로 구성된 MEF 배지로 해동합니다.
- DR4 MEF를 ~ 2 x 10⁴ cells/cm²에서 두 개의 10cm 접시에 플레이트하고 37°C에서 밤새 배양합니다.
- transfection 당일, iPSC에 transfection을 수행하기 30분 전에 MEF medium을 E8로 변경하고 10μM Y-27632를 보충합니다.
- 옵션: transfection 4시간 전, 최종 농도 10μM에서 Y-27632로 사전 transfection iPSC 배양을 보충합니다.
6. 전기천공법을 이용한 iPSC의 gentle-cell Dissociation 시약 처리 및 transfection
- P3 일차 세포 형질주입 용액을 4°C에서 제거하고 ~30분 동안 실온에 둡니다. 사용하기 전에 전체 100μl 보충제를 형질주입 용액에 추가합니다.
- 37°C 수조에서 따뜻한 부드러운 세포 해리 시약.
- -20°C에서 AAVS1 탈렌(pZT-AAVS1-L1 및 pZT-AAVS1-R1) 및 AAVS1-CAG-EGFP 공여체를 얻습니다.
- 인큐베이터에서 iPSC를 제거하고 DPBS로 한 번 세척합니다.
- 웰당 1ml의 부드러운 세포 해리 시약을 추가하고 37°C에서 5분 동안 또는 세포의 50% 이상이 배양 용기에서 분리될 때까지 iPSC를 배양합니다.
- p1000 피펫을 사용하여 세포를 위아래로 몇 차례 피펫팅하여 배양 용기에 남아 있는 세포를 분리하고 iPSC 덩어리를 분해합니다.
- 각 웰에 2ml의 E8 배지를 추가하고 10ml 피펫을 사용하여 위아래로 여러 번 피펫팅하여 세포 덩어리를 단일 세포로 추가로 분해합니다.
메모: transfection 효율은 세포 응집이 충분히 분해되지 않을 경우 크게 감소합니다.
- 15ml 원뿔형 튜브에 iPSC를 모으고 100 x g에서 3분 동안 원심분리합니다.
- 상층액을 흡인하고 최소량의 E8 배지에서 세포를 재현탁합니다.
- 0.4% Trypan blue와 같은 중요한 염색을 도포한 후 혈구계를 사용하여 세포를 계산합니다. 계수하는 동안 세포가 충분히 해리되었는지 확인합니다("덩어리"당 1-3개의 세포).
- 3 x 10⁶ 세포를 두 개의 15ml 원뿔형 튜브 각각에 분배하고 100 x g에서 3분 동안 다시 스핀다운합니다.
메모: 저속 원심분리는 세포 스트레스를 줄이고 전기천공법 전에 iPSC를 쉽게 재현탁할 수 있습니다.
- 전기천공법(electroporation) 시스템을 인간 배아 줄기세포주 H9(Program CB-150)에 대한 세포 유형별 프로그램으로 설정합니다.
- 원심분리 후, 세포 펠릿에서 상등액을 흡인합니다. 펠릿 1개에 HR donor 10μg을 대조군 샘플로 추가합니다. 다른 펠릿에 HR 공여체 10μg과 각 TALEN(pZT-AAVS1-L1 및 pZT-AAVS1-R1) 5μg을 실험 샘플로 추가합니다.
- 각 세포 펠릿을 100μl의 P3 일차 세포 형질주입 용액에 재현탁하고 큐벳으로 옮깁니다.
- transfection을 수행하고 즉시 각 큐벳에 500μl의 실온 E8 배지를 추가합니다.
- transfection된 iPSC를 5.4단계에서 준비한 DR4 MEF가 들어 있는 10cm 접시 하나에 적반합니다.