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1. 미세주입 혼합물을 위한 플라스미드 제조
참고: 여기에 설명된 프로토콜은 두 개의 플라스미드, 즉 관심 전이유전자를 운반하는 attB(숙주 박테리아에서 유래한 부착 부위) 태그가 지정된 공여 플라스미드와 초파리 Hsp70 프로모터의 조절에 따라 φC31 인테그레이스를 발현하는 보조 플라스미드의 사용을 포함합니다.
- 내독소가 없는 플라스미드 정제 키트를 사용하여 기증자 및 보조 플라스미드를 정제합니다.
메모: 모든 구성 요소의 무결성을 확인하기 위해 주입에 사용되는 최종 플라스미드 제제의 염기서열을 분석합니다.
- 적절한 양의 두 플라스미드를 결합하여 주입 완충액에 재현탁할 때 최종 농도가 350ng/μL의 공여 플라스미드와 150ng/μL의 보조 플라스미드인 혼합물을 얻습니다.
메모: 필요한 혼합물 부피를 계산할 때 계획된 주사일마다 10-15 μL가 충분하고 DNA를 미리 준비하고 -20 °C에서 보관할 수 있다는 점을 고려하십시오. 60-500 ng/μL의 Integrase helper plasmid 농도 및 85-200 ng/μL의 donor plasmid 농도도 보고되었습니다.
- 0.1 부피의 3 M 아세트산 나트륨 (pH 5.2)과 2.5 부피의 얼음처럼 차가운 100 % EtOH 및 와류를 첨가하여 DNA를 침전시킵니다. 흰색 침전물이 즉시 보여야 합니다. 고농축 초기 플라스미드 제제(즉, ~1 μg/μL)를 사용하면 침전 효율이 향상됩니다.
메모: 정지 지점 - 침전물은 -20 °C에서 밤새 보관할 수 있습니다.
- 15,000 x g에서 4°C에서 20분 동안 원심분리기를 하고, 상층액을 버리고, 펠릿을 얼음처럼 차가운 70% EtOH 1mL로 세척합니다.
- 펠릿을 얼음처럼 차가운 70% EtOH 1mL로 세척하고 실온에서 5분 동안 15,000 x g의 원심분리기를 사용합니다.
- 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 버리고 자연 건조하십시오.
- 펠릿을 1x 주입 완충액(0.1 mM Na3PO4, 5 mM KCl, pH 7.2, 0.22 μm 필터 멸균)에 재현탁시켜 총 최종 농도 500 ng/μL.
에 도달합니다.
메모: 침전 과정에서 일부 DNA가 손실된다고 가정합니다. 따라서 먼저 더 적은 부피의 주입 버퍼를 추가하고 분광 광도계(예: Nanodrop)에서 농도를 확인한 다음 500ng/μL에 도달하기 위해 적절한 잔류 부피를 추가합니다.
- DNA가 완전히 재현탁되었는지 확인하고 각각 10-15 μL의 분취액을 준비하고 -20 °C에서 보관합니다.
- 주입 당일, 부분 표본 1개와 원심분리기를 15,000 x g에서 5분 동안 해동하여 미립자 잔류물을 제거합니다.
참고: 미립자 제거를 위한 다른 방법은 0.22μm 필터를 통해 용액을 여과하는 것입니다. 주입 혼합물에 미립자 잔류물이 존재하면 배아 미세주입 중에 바늘이 막히므로 피하십시오.
2. Anopheles 도킹 라인에서 배아의 미세 주입
- 혈액은 미세 주입 72 시간 전에 원하는 도킹 라인에서 4-7 일 된 모기를 먹입니다 (즉, 월요일과 화요일에 주사하는 경우 이전 금요일에 암컷에게 먹이를 줍니다. 목요일과 금요일에 주사하는 경우 같은 주 월요일에 암컷에게 먹이를 줍니다).
- 혈액은 같은 날 야생형(WT) 모기(즉, 도킹 라인과 동일한 게놈 배경을 가진 모기)를 먹이로 공급합니다. 이들은 outcrossing에 필요할 것입니다.
메모: 혈액 가루의 크기와 질은 난자의 질에 영향을 미치므로 항상 신선한 혈액(즉, 이전 7일 이내에 채혈한 혈액)을 사용하는 것이 좋습니다. 팔로 먹이거나 쥐를 먹이면 난자의 질과 양이 증가할 수 있지만 이러한 방법은 권장되지 않습니다. 인간과 동물의 사용을 위해 승인된 특정 프로토콜이 필요합니다.
- 배아 미세주입 수행
배아의 - 후극을 45도 각도로 표적으로 하여 25mM NaCl에서 An. gambiae 배아 미세주입을 수행합니다. 배아 채취, 정렬 및 미세 주입에 대한 자세한 프로토콜은 Pondeville et al.을 참조하십시오.및 Lobo et al.
- 수행하다. 할로카본 오일에 700:27 (2:1)로 배아의 후극을 30도 각도로 표적으로 하여 배아 미세주입을 수행합니다. 배아 채취, 정렬 및 미세주입에 대한 자세한 프로토콜은 Terenius 등에서 찾을 수 있습니다.및 Lobo et al.
- 멸균 증류수(pH 7.2)로 채워진 페트리 접시에 주입 직후 난자를 옮기고 곤충 상태로 되돌립니다.
- 부화하면 G0 유충을 매일 소금에 절인 증류수(0.1% 강장염)가 담긴 트레이에 옮기고 번데기로 기릅니다.
- 부화율(즉, 부화한 유충 수/주입된 배아 수)을 기록합니다.
메모: 배아의 움직임은 부화를 돕기 때문에 부드러운 소용돌이가 바람직합니다. 부화는 주입 후 ~48시간 후에 시작해야 합니다. 주입은 약간의 발달 지연을 유발할 수 있으므로 3-4일 동안 늦게 부화하는 유충을 계속 모니터링하는 것이 좋습니다.