phiC31-Integrase-Mediated Site-Directed Transgene Integration: Anopheles 벡터에 부위 특이적 전이유전자 통합을 위한 미세주입 기술

1. 미세주입 혼합물을 위한 플라스미드 제조

참고: 여기에 설명된 프로토콜은 두 개의 플라스미드, 즉 관심 전이유전자를 운반하는 attB(숙주 박테리아에서 유래한 부착 부위) 태그가 지정된 공여 플라스미드와 초파리 Hsp70 프로모터의 조절에 따라 φC31 인테그레이스를 발현하는 보조 플라스미드의 사용을 포함합니다.

1. 내독소가 없는 플라스미드 정제 키트를 사용하여 기증자 및 보조 플라스미드를 정제합니다.
   메모: 모든 구성 요소의 무결성을 확인하기 위해 주입에 사용되는 최종 플라스미드 제제의 염기서열을 분석합니다.
2. 적절한 양의 두 플라스미드를 결합하여 주입 완충액에 재현탁할 때 최종 농도가 350ng/μL의 공여 플라스미드와 150ng/μL의 보조 플라스미드인 혼합물을 얻습니다.
   메모: 필요한 혼합물 부피를 계산할 때 계획된 주사일마다 10-15 μL가 충분하고 DNA를 미리 준비하고 -20 °C에서 보관할 수 있다는 점을 고려하십시오. 60-500 ng/μL의 Integrase helper plasmid 농도 및 85-200 ng/μL의 donor plasmid 농도도 보고되었습니다.
3. 0.1 부피의 3 M 아세트산 나트륨 (pH 5.2)과 2.5 부피의 얼음처럼 차가운 100 % EtOH 및 와류를 첨가하여 DNA를 침전시킵니다. 흰색 침전물이 즉시 보여야 합니다. 고농축 초기 플라스미드 제제(즉, ~1 μg/μL)를 사용하면 침전 효율이 향상됩니다.
   메모: 정지 지점 - 침전물은 -20 °C에서 밤새 보관할 수 있습니다.
4. 15,000 x g에서 4°C에서 20분 동안 원심분리기를 하고, 상층액을 버리고, 펠릿을 얼음처럼 차가운 70% EtOH 1mL로 세척합니다.
5. 펠릿을 얼음처럼 차가운 70% EtOH 1mL로 세척하고 실온에서 5분 동안 15,000 x g의 원심분리기를 사용합니다.
6. 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 버리고 자연 건조하십시오.
7. 펠릿을 1x 주입 완충액(0.1 mM Na₃PO₄, 5 mM KCl, pH 7.2, 0.22 μm 필터 멸균)에 재현탁시켜 총 최종 농도 500 ng/μL.
   에 도달합니다. 메모: 침전 과정에서 일부 DNA가 손실된다고 가정합니다. 따라서 먼저 더 적은 부피의 주입 버퍼를 추가하고 분광 광도계(예: Nanodrop)에서 농도를 확인한 다음 500ng/μL에 도달하기 위해 적절한 잔류 부피를 추가합니다.
8. DNA가 완전히 재현탁되었는지 확인하고 각각 10-15 μL의 분취액을 준비하고 -20 °C에서 보관합니다.
9. 주입 당일, 부분 표본 1개와 원심분리기를 15,000 x g에서 5분 동안 해동하여 미립자 잔류물을 제거합니다.
   참고: 미립자 제거를 위한 다른 방법은 0.22μm 필터를 통해 용액을 여과하는 것입니다. 주입 혼합물에 미립자 잔류물이 존재하면 배아 미세주입 중에 바늘이 막히므로 피하십시오.

2. Anopheles 도킹 라인에서 배아의 미세 주입

1. 혈액은 미세 주입 72 시간 전에 원하는 도킹 라인에서 4-7 일 된 모기를 먹입니다 (즉, 월요일과 화요일에 주사하는 경우 이전 금요일에 암컷에게 먹이를 줍니다. 목요일과 금요일에 주사하는 경우 같은 주 월요일에 암컷에게 먹이를 줍니다).
2. 혈액은 같은 날 야생형(WT) 모기(즉, 도킹 라인과 동일한 게놈 배경을 가진 모기)를 먹이로 공급합니다. 이들은 outcrossing에 필요할 것입니다.
   메모: 혈액 가루의 크기와 질은 난자의 질에 영향을 미치므로 항상 신선한 혈액(즉, 이전 7일 이내에 채혈한 혈액)을 사용하는 것이 좋습니다. 팔로 먹이거나 쥐를 먹이면 난자의 질과 양이 증가할 수 있지만 이러한 방법은 권장되지 않습니다. 인간과 동물의 사용을 위해 승인된 특정 프로토콜이 필요합니다.
3. 배아 미세주입 수행
   배아의
   1. 후극을 45도 각도로 표적으로 하여 25mM NaCl에서 An. gambiae 배아 미세주입을 수행합니다. 배아 채취, 정렬 및 미세 주입에 대한 자세한 프로토콜은 Pondeville et al.을 참조하십시오.및 Lobo et al.
   2. 수행하다. 할로카본 오일에 700:27 (2:1)로 배아의 후극을 30도 각도로 표적으로 하여 배아 미세주입을 수행합니다. 배아 채취, 정렬 및 미세주입에 대한 자세한 프로토콜은 Terenius 등에서 찾을 수 있습니다.및 Lobo et al.
   3. 멸균 증류수(pH 7.2)로 채워진 페트리 접시에 주입 직후 난자를 옮기고 곤충 상태로 되돌립니다.
4. 부화하면 G₀ 유충을 매일 소금에 절인 증류수(0.1% 강장염)가 담긴 트레이에 옮기고 번데기로 기릅니다.
5. 부화율(즉, 부화한 유충 수/주입된 배아 수)을 기록합니다.
   메모: 배아의 움직임은 부화를 돕기 때문에 부드러운 소용돌이가 바람직합니다. 부화는 주입 후 ~48시간 후에 시작해야 합니다. 주입은 약간의 발달 지연을 유발할 수 있으므로 3-4일 동안 늦게 부화하는 유충을 계속 모니터링하는 것이 좋습니다.