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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 프로토 스페이서 정의 및 플라스미드 구성
참고: 이 섹션에서는 sgRNA를 구성하고 pMaOri.dCas9로의 추가 결찰을 위해 적절한 protospacer를 선택하는 첫 번째 단계에 대해 설명합니다(그림 1). 이 프로토스페이서 서열은 원하는 표적에 대한 20개의 뉴클레오티드 서열로 구성됩니다.
- GenBank에서 침묵을 위한 관심 유전자의 뉴클레오티드 염기서열을 얻습니다(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank). "Fasta Target"을 선택한 후 Streptococcus pyogenes Cas9 및 protospacer 인접 모티프 NGG에 대해 정의된 매개변수와 함께 CHOPCHOP 웹 서버(http://chopchop.cbu.uib.no/)에 제출합니다. 매개변수를 "CRISPR/Cas9" 및 PAM(protospacer adjacent motif) NGG로 정의합니다.
- 얻은 결과를 바탕으로 코딩 영역의 5' 말단에 가능한 한 가깝게 위치하고, 가장 중요한 것은 sgRNA가 완전한 유전자 침묵을 위해 유전자의 코딩 가닥과 쌍을 이루어야 하기 때문에 템플릿(마이너스) 가닥에 포함되어 있는 가능한 가장 좋은 점수(녹색 화살표)를 가진 protospacer를 선택합니다.
메모: NGG 모티프는 최종 sgRNA 염기서열에 포함되지 않습니다.
- lipL32 promoter를 사용하여 5' 말단에 가변 20 뉴클레오티드 염기서열과 보존된 dCas9 스캐폴드 염기서열을 포함하는 단일 가이드 RNA를 발현합니다. protospacer라고 하는 20-nt 염기서열을 lipL32 promoter(5' 말단) 및 sgRNA scaffold(3' 말단)에 병합합니다(그림 1B).
메모: 잘 정의된 lipL32 promoter의 경우, TSS(Transcription Start Site, Zhukova et al.에 근거)에 -334를 포함하는 promoter region을 활용한다. 최종 sgRNA cassette에 대한 표 1을 확인하십시오.
- 순차 PCR로 sgRNA cassette를 생성하거나 상용 제공업체에서 합성할 수 있습니다.
- 카세트를 얻은 후 양쪽 끝의 XmaI 제한 부위(cccggg)에서 pMaOri.dCas9 플라스미드에 접합합니다.
- sgRNA 카세트와 pMaOri.dCas9 플라스미드를 XmaI 제한 효소로 분해하고 접합을 진행합니다(그림 1B).
- pMaOri(및 확장에 의해 pMaOri.dCas9) 복제 기원인 R6K-gamma.
로 인해 dT 보조영양 대장균 균주 π1에서 클로닝 단계를 수행합니다.
참고: ligation 및 clone selection에 대한 자세한 프로토콜은 Fernandes와 Nascimento의 이전 간행물을 참조하십시오. sgRNA-guided dCas9는 선택한 관심 유전자의 코딩 가닥에 결합하므로 RNA 중합효소 신장을 방해하여(그림 1C) 유전자 침묵을 초래합니다.
2. 활용에 의한 렙토스피라 변환
참고: 이 단계의 그래픽 구성표는 그림 2에 나와 있습니다. HAN 매체 및 HAN 플레이트를 만들려면 Hornsby et al. 및 Fernandes et al.을 참조하십시오.
- 29 또는 37 °C에서 병원성 렙토스피라 세포를 신선한 HAN에서 포화 배양액을 1:100으로 희석하여 교반 하에서 HAN 배지에서 성장시키며, 일반적으로 L. interrogans serovar Copenhageni 균주 Fiocruz L1-130은 적절한 세포 밀도에 도달하는 데 4-6일이 걸립니다.
- conjugation.
에 사용하기 전에 배양액이 420nm(2 - 5 x 108 cells/mL)에서 O.D. 0.2-0.4에 도달하도록 합니다.
메모: 세포 밀도가 증가함에 따라 HAN 배지의 색이 변하기 때문에(DMEM 배지에 함유된 페놀 레드로 인해) 원심분리기(4,000 x g, 15분, 실온)의 배양 배지 1mL를 사용하여 렙토스피어를 제거하고 상등액을 O.D. 측정을 위한 블랭크로 도포합니다.
- sgRNA 카세트를 포함하는 플라스미드 pMaOri.dCas9를 사용하여 Diaminopimelic acid (DAP)에 대한 보조영양 conjugative E. coli strain β2163을 형질전환시킵니다. 대장균 변형을 위해서는 열 충격 프로토콜 또는 전기천공법을 사용하십시오. sgRNA 카세트가 없는 플라스미드 pMaOri.dCas9를 대조군으로 사용하여 형질전환을 포함합니다.
- 열 충격 변형을 위해 플라스미드 DNA(100ng)를 화학적으로 적합한 대장균 세포와 혼합하고 얼음에서 30분 동안 배양합니다. 42°C에서 90초 동안 열 충격을 가한 후 다시 얼음 위에 5분 동안 놓습니다. LB 배지 1mL를 추가하여 세포를 회수하고 37°C에서 1시간 동안 배양한 후 도금을 진행합니다.
- 전기천공을 위해서는 100ng의 플라스미드 DNA와 혼합된 전기 역량 세포를 사용하십시오. 펄스에 대해 1.8kV, 100 Ω 및 25μF 매개변수를 사용합니다. 위에서 설명한 대로 셀을 복구합니다.
- Diaminopimelic acid(DAP)(0.3mM) 및 spectinomycin(40μg/mL)이 보충된 LB 한천 배지에 형질전환된 donor E. coli 세포를 플레이트화하여 플라스미드를 선택합니다.
- 접합의 경우, 접합일 하루 전에 각 플레이트에서 하나의 콜로니를 선택합니다(이는 렙토스피어 배양의 O.D.를 모니터링하여 결정됨).
- 빈 pMaOri.dCas9에서 E. coli β2163 콜로니 하나를 선택하고 pMaOri.dCas9sgRNA 플레이트에서 하나를 선택합니다. 37°C에서 10mL의 LB와 DAP 및 스펙티노마이신을 하룻밤 동안 자라게 합니다.
- 다음날, 포화 배양액을 10mL의 신선한 LB와 DAP(여기에 항생제는 포함하지 않음)에 0.2-0.4의 OD420nm까지 1:100으로 희석합니다. 일반적으로 대장균이 이 밀도에 도달하는 데 2-3시간이 걸립니다.
- BSL2 생물 안전 후드 내부에 유리 베이스 상단에 직경 25mm, 공극 크기 0.1μm, 혼합 셀룰로오스 에스테르 멤브레인 필터를 배치하여 여과 장치를 조립합니다. 상단에 15mL 유리 깔때기를 놓고 스프링 클램프로 두 조각을 모두 잡습니다. 유리를 진공 펌프에 연결하고 여과를 위해 깔때기에 배양물을 추가합니다.
- 깔때기에 렙토스피라 배양액 5mL를 추가합니다. 두 배양의 OD420nm 값을 기준으로 1:1 비율을 구성하기 위해 E. coli의 부피를 추가합니다. 진공 펌프를 켜고 여과로 셀을 농축합니다. 멤브레인 필터에서 세포를 농축한 후 조심스럽게 회수합니다. 매체가 멤브레인을 통해 여과되었는지 확인합니다.
메모: 여과에는 5분에서 10분 정도 걸립니다.
- DAP(0.3mM)가 보충된 시중에서 판매되는 EMJH 플레이트(재료 표 참조)에 필터를 놓습니다. 박테리아 쪽이 위로 향하는지 확인하십시오. 플레이트를 29 °C에서 24 시간 동안 배양
메모: HAN 또는 보충된 사내 EMJH 플레이트를 사용하면 E. coli가 증식하여 의도한 1:1 비율을 극복할 수 있으며, 이로 인해 접합 효율이 감소할 수 있습니다.
- 24시간 후 플레이트에서 필터를 회수하고 각 필터를 50mL 원뿔형 튜브에 넣습니다.
- 1mL의 액체 HAN 배지를 사용하여 광범위한 피펫팅 및 볼텍싱을 통해 필터 표면에서 세포를 분리합니다.
- 세포의 생존력과 운동성을 확인하기 위해 암시야 현미경으로 회수된 혼합 박테리아 용액을 시각화하고 Leptospira:E. coli proportions.
메모: 이 단계에서는 동일한 수의 E. coli와 Leptospira를 볼 수 있습니다.
- 이 배양액 100-200 μL를 0.4% 불활성화 토끼 혈청과 40 μg/mL 스펙티노마이신이 함유된 HAN 플레이트에 펴 바릅니다. 37 ° C에서 3 % CO2 기압으로 플레이트를 배양합니다 .
strong>참고: 일반적으로 L. interrogans serovar Copenhageni 균주 Fiocruz L1-130 세포는 대조판에서 5-7일, 스펙티노마이신 판에서 8-10일 이내에 군체를 형성합니다. 이 단계에서 대장균은 DAP에 대한 보조영양성이기 때문에 성장하지 않습니다.
- 대조군으로, 배양액을 104 leptospires/mL로 희석하고 항생제 없이 플레이트에 100μL를 첨가하여 렙토스파이럴 성장을 모니터링합니다.