siRNA 역형질주입 기반 유전자 침묵 In vitro: 표적 유전자 발현을 비활성화하기 위해 배양된 세포에 작은 간섭 RNA를 전달하는 절차

초록

출처: Jager, J. et al.단백질 및 마이크로 RNA 조절이 지방 세포 기능에 미치는 영향을 연구하기 위한 지방 세포 배양 모델. J. Vis. 특급 (2021).

이 비디오에서는 siRNA를 지방 세포로 역형질주입하여 표적 단백질의 발현을 조절하는 절차를 설명합니다.

프로토콜

1. 사전 코팅된 플레이트의 준비

1. 형질주입 하루 또는 몇 시간 전에 1mg/mL의 원액에서 30% 에탄올 중 100μg/mL의 콜라겐 I형 용액을 준비합니다. 12웰 플레이트의 웰당 콜라겐 250μL와 24웰 플레이트의 웰당 125μL를 추가하고 웰 표면에 용액을 펴 바릅니다.
2. 콜라겐이 마를 때까지 접시를 뚜껑 없이 배양 후드 아래에 두십시오. Dulbecco의 인산염 완충 식염수(D-PBS)로 두 번 세척합니다.
   알림: 사전 코팅된 플레이트를 구입할 수 있습니다.

2. transfection mix의 준비

>참고: siRNA의 최종 농도는 1 - 100 nM (12-well plate의 well당 siRNA 1 - 100 pmol)입니다. miR 모방체의 최종 농도는 10nM(10pmol/well)입니다. off-target 효과를 방지하기 위해 실험을 시작하기 전에 각 siRNA, miR mimic 또는 기타 올리고뉴클레오티드의 최적 농도를 결정합니다. 결과의 통계적 분석을 용이하게 하기 위해 transfection 실험을 3회에 걸쳐 수행합니다. 파이펫팅 중 정상적인 손실을 설명하기 위해 과도하게 모든 시약을 준비합니다.

1. siRNA(또는 기타 올리고뉴클레오티드)를 피펫팅(부피/부피)하여 개선된 최소 필수 배지(Minimal Essential Medium)와 혼합합니다(표 1). 실온에서 5분 동안 배양합니다.
2. transfection 시약과 개선된 Minimal Essential Medium을 siRNA에 첨가하고 피펫으로 혼합합니다(표 1). 실온에서 20분 동안 배양합니다(이 시간 동안 섹션 3으로 진행). transfection 혼합물을 collagen-coated plate의 각 well에 첨가합니다.

3. 3T3-L1 지방세포의 준비

1. 100mm 페트리 접시의 세포를 D-PBS로 두 번 세척합니다. 세포에 5x 트립신을 추가하여(100mm 접시당 1mL) 모든 표면을 트립신으로 덮습니다. 30초 동안 기다렸다가 트립신을 조심스럽게 제거합니다.
2. 인큐베이터에서 37°C에서 5-10분 동안 페트리 접시를 배양합니다. 100mm 접시를 두드려 셀을 분리합니다.
3. 피루베이트가 없는 DMEM 10ml, 포도당 25mM, FCS 10%, 페니실린 및 스트렙토마이신 1%를 첨가하여 트립신을 중화합니다. 배지를 위아래로 조심스럽게 피펫팅하여 세포를 분리하고 세포 현탁액을 균질화합니다.
4. Malassez 계수 챔버 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수하고 세포 농도를 6.25 x 10⁵ cells/mL 배지로 조정합니다. 12웰 플레이트(5 x 10,⁵ 셀)의 세포 현탁액/웰 800 μL 또는 트랜스펙션 혼합물을 포함하는 24웰 플레이트(2.5 x 10,⁵ 셀)의 세포 현탁액/웰 400 μl를 시드합니다.
   메모: 지방 세포의 100mm 페트리 접시 하나를 사용하면 12웰 플레이트 1개 또는 24웰 플레이트 1개를 준비할 수 있습니다. 100mm 접시에는 일반적으로 6-7 x 10⁶ 개의 지방 세포가 포함되어 있으며, 이는 12 웰 플레이트의 웰 당 5 x 10⁵ 개의 지방 세포에 해당합니다.
5. 세포 배양 인큐베이터(7% CO2 및 37°C)에서 플레이트를 배양하고 24시간 동안 세포를 방해하지 마십시오. 다음 날, 피루브산, 포도당 25mM, FCS 10%, 페니실린 및 스트렙토마이신이 없는 새로운 DMEM으로 상등액을 조심스럽게 교체하십시오.
   참고: 세포를 콜라겐이 미리 코팅된 48웰 및 96웰 플레이트에 파종하는 것도 가능하지만 배지를 교체할 때 지방 세포가 분리되지 않도록 더 많은 예방 조치를 취해야 합니다.

	웰당(12웰 플레이트)	웰당(24웰 플레이트)
올리고뉴클레오티드	20 μL	10 μL
(si-RNA, miR...)
개선된 Minimal Essential Medium	20 마이크로L	10 μL
트랜스펙션(Transfection) 시약	5.6 μL	2.8 μL
개선된 Minimal Essential Medium	154.4 μL	77.2 μL
transfection mix의 총 부피	200 마이크로L	100 마이크로L

표 1: 12-well 및 24-well 플레이트 형식에 필요한 transfection 시약.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
12 웰 조직 배양 플레이트	더처	353043
2.5% 트립신(10배)	지브코	제15090-046	D-PBS로 5배로 희석
2-프로판올	시그마	I9516 (영어
3-이소부틸-1-메틸크산틴	시그마-알드리치	D5879
소 혈청 알부민(BSA)	시그마	A7030
종아리 피부의 콜라겐 I 형	시그마-알드리치	C8919
덱사메타손	시그마-알드리치	D1756
디-PBS	지브코	14190144
둘베코의 변형 독수리 매체(DMEM)	지브코	41965062	4.5 g/L D 포도당; L-글루타민; 피루브산 무함유
에탄올	시그마	51976
miRIDIAN 마이크로 RNA 모방	호라이즌 디스커버리
FAM 표지 음성 대조군 siRNA	인비트로젠	AM4620
신생아 송아지 세럼	지브코	16010-159
소 태아 세럼	지브코	10270-106
페니실린과 스트렙토마이신	지브코	15140-122
FAM 표지 음성 대조군 siRNA	인비트로젠	AM4620
ON-TARGETplus 마우스 Plin1 siRNA SMARTpool	호라이즌 디스커버리	L-056623-01-0005
유리 글리세롤 시약	시그마-알드리치	F6428
페트리 접시 100mm×20mm	더처	353003
트랜스펙션 시약(INTERFERin)	폴리플러스	409-10
향상된 최소 필수 매체(Opti-MEM)	지브코	31985-047
인슐린, 인간 재조합	지브코	제12585-014

호 ) 년 년 년 년 년 년 호