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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 관심유전자(GOI)를 발현하는 반응 플라스미드를 일차 폐포 상피 세포로 형질주입
- 쥐의 폐에서 II형 폐포 상피 세포를 분리합니다.
- 완전한 최소 필수 배지(완전한 MEM)를 사용하여 100mm 페트리 접시에 1 x 106 cells/cm2의 밀도로 세포를 파종합니다. Complete MEM은 10% FBS, 0.08mg/L 토브라마이신, Septra (3 μg/mL 트리메토프림 및 17 μg/mL 설파메톡사졸), 0.2% NaHCO3, 0.01 M HEPES(pH = 7.3) 및 2 mM L-글루타민이 보충된 MEM입니다. 가습 인큐베이터에서 37°C에서 24시간 동안 5%CO2로 세포를 배양합니다.
- 다음 날, 새로운 12 웰 플레이트의 각 웰에 항생제가 없는 완전한 MEM 500μL를 놓고 플레이트를 37°C에서 30분 동안 예열합니다. 이 단계에서는 테트라사이클린이 오염되지 않거나 유도를 방해할 수 없을 정도로 낮은 수준의 소 태아 혈청을 사용하는 것이 중요합니다.
- RT에서 웰당 1μg의 GOI 플라스미드와 1μg의 조절 벡터를 추가하여 유도성 GOI(GOI 플라스미드) 및 조절 벡터(예: pTet-Off)가 포함된 플라스미드를 포함하는 1.5mL 튜브를 준비합니다. RNA 결합 단백질(RBP)을 사용한 동시 발현 실험의 경우, 관심 RPB를 발현하는 구성 벡터(예: pcDNA3) 1μg을 DNA 믹스에 추가합니다(그림 4).
- 배지를 흡인하고 37 ° C에서 예열 된 PBS (칼슘 및 마그네슘 없음)로 세포를 부드럽게 헹굽니다.
- 37°C에서 예열된 0.05% 트립신 5mL를 추가하고 세포가 분리될 때까지(2-4분) 세포를 배양합니다. 항생제 없이 10mL의 완전한 MEM을 첨가하여 트립신을 중화합니다.
- 50mL 튜브에 세포 현탁액을 모으고, 페트리 접시를 4mL의 배지로 세척하여 가능한 한 많은 세포를 수집한 다음, 300 x g에서 5분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다.
- 상층액을 부드럽게 흡입하고 버리고 펠릿을 PBS 1mL에 재현탁합니다. 혈구계를 사용하여 세포 수를 세고 계산합니다.
- 300 x g에서 5분 동안 세포를 원심분리하고 상층액을 부드럽게 흡인하고 펠릿을 4 x 107 cells/mL의 농도로 재현탁액에 재현탁합니다. 2.4단계에서 준비한 1.5mL 튜브의 세포를 웰당 400,000개의 세포 농도로 첨가하고 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다.
- 튜브를 전기천공법 장치에 넣고 3.5mL의 전해 완충액을 채웁니다.
- 피스톤을 완전히 눌러 금도금된 전극 팁을 피펫에 삽입합니다. 1.5mL 튜브의 내용물을 부드럽게 혼합하고 피펫으로 세포를 조심스럽게 흡인합니다. 기포가 팁으로 유입되지 않도록 주의하면 전기천공법 중에 전기 아크가 발생하고 형질주입 효율이 저하될 수 있습니다.
- 딸깍 소리가 날 때까지 피펫을 전기천공 스테이션에 삽입합니다.
- 1,450V의 펄스 전압과 20ms 너비의 펄스 2개에 해당하는 폐포 상피 세포에 적합한 electroporation 프로토콜을 선택하고 터치스크린에서 Start를 누릅니다.
- transfection 직후, 피펫을 제거하고 37°C로 예열된 항생제 없이 완전한 MEM으로 이전에 채워진 well로 세포를 옮깁니다.
- 나머지 샘플에 대해 1.11-1.14단계를 반복합니다.
- 플레이트를 부드럽게 흔들어 웰 표면에 세포를 고르게 펴 바릅니다. 가습 인큐베이터에서 37 ° C의 5 % CO2 세포를 배양합니다. 2일 후, 완전한 MEM이 있는 배지를 항생제로 교체하십시오.
- 형광 현미경에서 eGFP의 발현을 관찰하거나 control vector를 사용하여 유세포 분석으로 transfection의 성공 여부를 확인합니다(그림 1).
메모: 이 단계는 선택 사항이며 pcDNA3-EGFP와 같은 eGFP를 발현하는 다른 플라스미드를 사용하는 추가 transfection 단계가 필요합니다.
2. GOI의 전사 억제 유도
참고: mRNA 안정성에 미치는 영향을 평가하기 위해 독시사이클린 유도 전에 세포를 원하는 처리로 전처리할 수 있습니다(그림 3).
- 탈이온수에 1mg/mL의 독시사이클린 원액을 준비합니다. 원액을 빛으로부터 보호되는 -20°C에서 보관하십시오. 테트라사이클린 유도체인 독시사이클린은 테트라사이클린보다 반감기(2x)가 길기 때문에 테트라사이클린 대신 사용됩니다. 또한, tet operon의 완전한 비활성화를 위해서는 더 낮은 농도의 독시사이클린이 필요합니다.
메모: 독시사이클린은 내인성 GOI의 mRNA 발현에 영향을 미칠 수 있습니다. 이를 확인하기 위해 폐포 세포에 대한 독시사이클린을 24시간 투여한 효과를 테스트하여 GOI 발현에 변화가 없는지 확인해야 합니다(그림 2).
- transfection 72시간 후 완전한 MEM에서 새로운 1μg/mL 독시사이클린 용액을 준비하고 37°C로 예열합니다.
- 배지를 웰당 1μg/mL 독시사이클린을 함유한 완전한 MEM 1mL로 교체하여 GOI의 전사를 억제합니다.
- GOI의 mRNA 반감기를 평가하기 위해 15분-6시간 동안 37°C에서 5% CO2로 여러 웰을 배양합니다.
- 처리가 끝나면 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 세척하고 웰당 500μL의 완충액을 추가하고 플레이트를 흔들어 세포를 균질화하여 시중에서 판매되는 페놀-클로로포름 RNA 추출 키트로 용해합니다.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 RNA를 분리합니다. 230, 260 및 280nm에서 분광 광도계로 RNA 수율과 순도를 측정합니다. 260:230 및 260:280 비율이 각각 1.8 및 2.0인 RNA 샘플은 pure.
로 간주됩니다.
메모: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
