애기장대 식물의 이진 박테리아 인공 염색체 벡터 기반 유전자 변환: 단일 사본 삽입으로 형질전환 식물을 생성하는 기술

1. 애기장대 변형

1. 변형을 위해 애기장대 식물을 준비합니다.
   1. 애기장대 식물은 꽃이 필 때까지 온실 또는 기후 조절 성장 챔버에서 재배합니다 (12 화분에 각각 9 개의 식물이 있음).
   2. 더 많은 보조 볼트가 나오도록 첫 번째 볼트를 클립합니다. 식물은 잘라낸 후 4-6 일 후에 담글 준비가되며, 식물에는 미성숙 한 꽃 머리가 많고 수정 된 실리크가 많지 않습니다.
2. 플로럴 디핑
   1. 이원 박테리아 인공 염색체 또는 BIBAC으로 복제된 T-DNA를 운반하는 Agrobacterium 현탁액에 5-10초 동안 꽃차례를 담그십시오. 부드럽게 저어주세요.
   2. 식물의 지상 부분을 접착 필름으로 싸서 습도를 높게 유지하고 화분을 상자로 덮어 식물을 어둡게 유지합니다. 온실/성장실에서 2일 동안 식물을 배양합니다.
   3. 상자와 접착 필름을 제거하고 온실 / 성장 챔버에서 식물을 성숙하게 자랍니다 .
      메모: 변형의 효율성을 높이기 위해 동일한 식물을 첫 번째 담글 후 7일 후에 다시 담글 수 있습니다.
   4. 씨앗을 수확하십시오. 동일한 구조로 변형된 식물의 씨앗(T1)을 단일 세트로 풀링하고 분석합니다.
3. 형질전환 식물을 위한 스크리닝.
   1. pBIBAC-RFP-GW 유도체로 형질전환된 형질전환 식물을 스크리닝하려면 형광 현미경을 사용하여 씨앗을 분석합니다. 종마모에서 DsRed 발현을 검출하려면 560nm의 여기(excitation)와 600–650nm의 방출에서 시드를 이미지화합니다. 겸자를 사용하여 형광 씨앗을 형광성이 아닌 형광 씨앗과 분리합니다.
   2. pBIBAC-BAR-GW 유도체로 형질전환된 형질전환 식물을 스크리닝하려면 토양(~2,500 종자/0.1 m²)으로 채워진 트레이에 종자를 파종합니다. 트레이에 씨앗이 고르게 퍼지도록 0.5x Murashige Skoog 배지(MS)의 0.1% 한천에 씨앗을 현탁시키고 1mL 피펫을 사용하여 씨앗을 펴 바릅니다.
      메모: 씨앗이 동기 방식으로 발아하도록 자극하려면 4 ° C에서 최소 2 일 동안 씨앗을 배양하십시오. 이것은 씨앗을 파종하기 전이나 후에 수행 할 수 있습니다.
      1. 쟁반에 파종한 후 2주와 3주 후에 0.5% 글루포시네이트-암모늄 용액을 묘목에 뿌립니다. 1m당 500mL의 글루포시네이트-암모늄 용액을 사용합니다.
      2. 살아남은 묘목을 개별 화분으로 옮깁니다. (두 번째) 글루포시네이트-암모늄 처리 전후의 묘목이 있는 트레이의 일반적인 이미지가 그림 1에 나와 있습니다.
      3. PCR로 글루포시네이트-암모늄 저항성 식물을 분석하여 관심 구조체의 존재 여부를 확인합니다.
         1. PCR을 위해 게놈 식물 DNA를 분리합니다.

그림 1: 글루포시네이트-암모늄 처리 전후에 애기장대 묘목으로 채워진 트레이. pBIBAC-BAR-GW T-DNA에 존재하는 bar gene을 발현하지 않는 묘목은 Glufosinate-ammonium solution을 분사한 후 사멸합니다. 사진은 (A) 파종 후 14일 후에 글루포시네이트 암모늄을 살포하기 전과 (B) 두 번 살포한 후 10일 후의 동일한 묘목 트레이를 보여줍니다.