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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 모르폴리노 올리고 디자인
참고: A. mexicanus의 염기서열은 NCBI(National Center of Biotechnology Information) 유전자 및 NCBI SRA(https://www.ncbi.nlm.nih.gov) 및 Ensembl 게놈 브라우저(https://www.ensembl.org)를 통해 사용할 수 있습니다. 지표 및 동굴 거주 형태 모두에 사용하기 위해 morpholino를 설계할 때는 이 단계에서 morpholino 간의 유전적 변이를 식별하는 것이 중요하므로 이러한 유전적 영역이 morpholinos의 표적으로 사용되는 것을 피할 수 있습니다. morpholino 타겟 부위 내의 모든 다형성 변이는 비효율적인 결합으로 이어질 수 있습니다. 이 디자인은 제브라피시와 같은 다른 물고기 시스템과 유사하며 이전에 A. mexicanus에서 효과적으로 작동하는 것으로 나타났습니다.
- 번역 차단 morpholinos의 디자인
메모: translation-blocking morpholinos는 내인성 시작 부위에 결합하여 번역을 차단하고 입체 장애를 통해 mRNA 염기서열에 결합하는 번역 기계를 방해합니다.
1. ATG 시작 부위부터 시작하는 타겟 유전자의 코딩 영역을 식별합니다.
2. 텍스트 편집기 또는 실습 노트북에서 염기서열을 복사하여 붙여넣어 대상 염기서열의 처음 25개 염기쌍을 기록합니다.
3. 온라인 소프트웨어(예: http://reverse-complement.com) 또는 수동 번역을 사용하여 타겟 염기서열의 역보체를 생성합니다. 결과 역방향 보완을 텍스트 편집기 또는 랩 노트북에 저장합니다.
4. 모르폴리노 올리고뉴클레오티드를 생성하는 회사에서 역보체 염기서열이 있는 모르폴리노를 주문합니다. 기업용 재료 표를 참조하십시오.
2. 미세주입
- 주사를 위한 일반 도구의 준비
메모: 이 섹션의 절차는 다른 곳에서 자세히 설명되었으며, 약간의 수정 사항이 포함된 개요가 여기에 나와 있습니다.
- 어류 시스템 물에 용해된 따뜻한 3% 아가로스를 100mL 페트리 접시에 부어 주입 플레이트를 생성합니다. 갓 부은 아가로스에 계란 주입 틀을 조심스럽게 넣어 물고기 알을 위한 우물을 만듭니다. 한천에 곰팡이의 측면을 45° 각도로 놓고 천천히 한천으로 내립니다. 금형을 비스듬히 천천히 내리면 공기가 금형 아래에 갇히는 것을 방지할 수 있습니다. 아가로스가 응고되면 곰팡이를 부드럽게 제거합니다. 플레이트는 최대 1주일 동안 4°C에서 밀봉하여 보관할 수 있습니다.
- 단세포 단계 난자 수집
- 번식이 예상되는 밤에는 15-30분마다 수조를 검사하고 수조 바닥에 알이 있는지 모니터링합니다. 알은 반투명하게 보이며 지름은 약 1mm입니다.
- 가는 그물망을 사용하여 알을 모아 신선한 생선 시스템 물로 채워진 유리 그릇에 옮깁니다. 현미경으로 난자를 검사하여 난자가 단세포 단계에 있는지 확인합니다.
- 유리 피펫을 사용하여 단세포 난자를 주입 플레이트로 옮깁니다. 이 단계에서는 계란이 플라스틱에 달라붙기 때문에 유리 피펫이 필요합니다.
- 피펫을 사용하여 섹션 2.1의 아가로스 주입판의 웰로 계란을 조심스럽게 방출합니다. 예열된(실온에서) 주입 플레이트의 행을 최대 난자 수(행당 30-40개, 최대 5줄)로 채웁니다. 가득 찬 줄은 주사 중에 난자가 움직이지 않도록 하는 데 도움이 됩니다. 주사가 수행될 때까지 소량의 물고기 시스템 물과 함께 주입 플레이트에 계란을 수화시켜 유지하십시오.
- Pico 주입 설정 및 일반 주입 최적화 지침
- 모세관 내부에 맞는 젤 로딩 피펫 팁을 사용하거나 표준 마이크로피펫 팁을 사용하여 끝에 2–4 μL 볼루스를 추가하여 주사 바늘을 다시 채웁니다. 바늘이 채워지면 집게를 사용하여 주사 바늘의 여분의 길이를 다듬습니다.
- picolitre microinjector에 연결된 micromanipulator에 장착된 바늘을 사용하여 microinjection을 수행합니다.
- 사출 시간을 0.03초로 설정하고 압력을 ~0.0psi로 설정합니다. 주입 압력은 바늘 간의 사소한 차이에 따라 변하므로 ~1.0nL 주입 bolus.
를 달성하도록 최적화합니다.
메모: 사출 압력은 종종 ~10–30psi 범위입니다.
- 미네랄 오일에 주입하고 슬라이드 마이크로미터로 볼루스 크기를 측정하여 주입 볼루스를 표준화하여 ~1–1.5nL 주입량을 달성합니다. 사출 압력(psi)을 조정하여 볼루스 부피를 늘리거나 줄입니다.
- 실험실 티슈를 사용하여 달걀 맨 위에서 물을 끌어냅니다.
메모: Astyanax 알 융모는 제브라피쉬 알보다 침투하기가 약간 더 어렵습니다. 우리는 달걀 윗부분에서 물을 빼내는 것이 난자에 바늘이 쉽게 침투할 수 있도록 돕는다는 것을 발견했습니다. 플레이트 최적화는 단일 플레이트에 ~200개의 계란을 허용할 수 있습니다.
- 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 바늘로 각 계란을 관통하고 노른자에 직접 주입합니다. 노른자에 넣으면 주입 버튼이나 주입 풋 페달을 눌러 계란을 주입합니다.
메모: 전체 플레이트는 ~ 15 분 이내에 주입 할 수 있습니다. 단일 셀 단계는 ~40분 동안 지속됩니다.
- morpholinos
주입
메모: 독성을 일으키지 않고 녹다운하는 데 필요한 모르폴리노의 양은 유전자 표적별로 최적화되어야 합니다. 그러나 400pg의 농도가 시작하기에 좋은 곳입니다.
- 난자당 400pg의 모르폴리노가 주입되도록 모르폴리노를 준비합니다. 얼음 위에서 모르폴리노를 해동합니다. 주입 용액은 morpholino(원하는 농도), RNase-free H2O 또는 Danieau's solution, 페놀 레드(최종 부피의 10%)로 구성됩니다. 예를 들어 표 1을 참조하십시오.
- 배아당 1nL를 주입합니다.