Tol2 Transposon-Mediated Zebrafish Transgenesis: 수정된 제브라피시 배아에 Tol2 시스템을 동시 주입한 후 형질전환 제브라피시를 생성하는 절차

초록

출처: Silic, M. R., et al. 제브라피시 초기 배아 및 종양에서 세포 전기 활동의 시각화. J. Vis. 특급 (2018)

이 비디오에서는 형광 전압 지시자를 인코딩하는 전이효소 mRNA 및 Tol2 전이 구축물을 포함하는 Tol2 전이 시스템의 동시 주입 후 형광 전압 지시 단백질을 구성적으로 발현하는 안정적인 제브라피시 형질전환 라인을 생성하는 절차를 보여줍니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 미세 주입

1. 주입 전 오후에 최소 2 명의 수컷과 2 명의 암컷으로 4-6 개의 번식 탱크를 설치하십시오. 이 물고기는 오후에 먹이를 주어서는 안 됩니다. 이 단계는 물고기 배설물의 양을 줄이고 다음날 아침에 물고기를 청소하는 시간을 절약하는 동시에 번식 반응을 유도하는 데 도움이 됩니다.
2. 다음 날 아침, (i) 제브라피시 유비퀴틴 프로모터와 형광 전압 지시 유전자 ASAP1(Accelerated Sensor of Action Potentials 1) 및 (ii) Tol2 mRNA를 포함하는 Tol2 트랜스포손 구조체로 구성된 준비된 주사 용액을 -80°C 냉동고에서 꺼내 얼음 위에 놓습니다.
3. 물고기 사육 탱크의 칸막이를 당기고 물고기가 짝짓기를 할 수 있도록 합니다. 일반적으로 물고기는 칸막이를 꺼낸 후 20-30분 이내에 알을 낳습니다. 그렇지 않은 경우 1-2시간 더 기다립니다. 일부 물고기는 알을 전혀 낳지 않을 수 있습니다. 이 경우 어류 배아 수집에 대해 이 실험을 반복합니다.
4. 기다리는 동안 팁이 비스듬히 부러져 집게로 비스듬한 가장자리를 만들거나 섬세한 작업 와이퍼를 부러뜨린 바늘이 준비되어 있는지 확인하십시오.
   1. 다음 매개변수를 사용하여 마이크로피펫 풀러의 모세관 유리에서 바늘을 당깁니다: 열 545; 당기기 60; 속도 80; 시간 250; 압력 500. 해부 내시경(직경 추정을 위한 접안렌즈 자 포함) 아래에 있는 집게로 집게를 약 45° 각도로 잡고 바늘을 부러뜨립니다. 원하는 바늘 직경은 마이크로인젝터 설정에 따라 달라질 수 있지만, 배아 폐사율을 줄이기 위해 더 작은 직경이 선호됩니다.
5. 물고기가 알을 낳으면 직경 10cm의 페트리 접시에 모아 해부 스코프로 가져갑니다. 모든 비정상적인 배아와 물고기 배설물을 제거하십시오.
6. 준비된 3% 아가로스 사출 금형에 수정된 배아를 피펫으로 넣습니다. 배아가 제자리에 고정되도록 여분의 물을 제거하십시오.
7. 모든 열이 생존 가능한 배아로 채워지면 단일 세포가 모두 바늘을 향해 같은 방향(수평으로 약 45° 각도)을 향하도록 배열합니다. 이렇게 하면 나중에 주입이 훨씬 쉬워집니다.
8. 장갑을 착용한 상태에서 20 μL 로딩 피펫 팁을 사용하고 얼음 위의 튜브에서 준비된 구조물 5 μL를 제거합니다.
9. 시약이 팁에 최대한 가깝게 되도록 끊어진 모세관 뒤쪽 끝에 팁을 조심스럽게 삽입하여 두드리기 시작하는 위치까지 삽입합니다. 그래도 기포가 남아 있으면 바늘 끝이 부러지지 않도록 바늘을 흔듭니다.
10. 바늘을 마이크로 주입 바늘 홀더에 똑바로 삽입하고 바늘이 제자리에 고정될 때까지 조심스럽게 조입니다. 각도를 약 45°로 조정합니다.
11. 바늘이 준비되고 부착되면 현미경과 가스 압력 탱크를 켭니다. 상업용 CO₂ 탱크는 일반적으로 이러한 목적에 적합합니다. 주입량은 유지 압력과 배출 압력에 의해 조정됩니다: 유지의 경우 약 0.5psi, 배출의 경우 약 30psi입니다. 페달을 밟을 때 용액이 나오는지 반드시 확인하십시오.
12. 미네랄 오일 한 방울이 있는 스테이지 마이크로미터를 사용하여 용액의 부피와 흐름을 직경 ~150μm(약 2nL)로 조정합니다. 배압으로 인해 바늘에서 소량이 떨어지는지 확인하십시오. 배압이 충분하지 않으면 모세관 작용으로 인해 액체가 바늘에 들어가 mRNA를 파괴합니다.
13. 바늘이 보정되면 수정된 배아의 단세포에 구조체를 주입하기 시작합니다.
    메모: 이것은 세포막을 뚫기 어렵기 때문에 많은 연습, 인내심 및 기교가 필요합니다. 형질전환 제브라피시를 생성하기 위해 난황이 아닌 세포에 용액을 주입하는 것이 중요합니다. 이것은 모르폴리노 주입과 다릅니다. 구조체가 세포 안으로 들어가는 한 바늘이 어느 쪽으로 세포에 들어가는지는 중요하지 않습니다. 형질전환은 세포 대신 난황에 주입될 경우 성공률이 매우 낮습니다. 단일 세포 단계 주입도 중요하며, 그렇지 않으면 체세포 키메라 물고기가 생성됩니다. 이렇게 하면 형질전환 유전자가 생식 세포로 들어갈 확률이 줄어듭니다.
14. 젤 노치의 가장자리를 사용하여 배아를 제자리에 유지하고 배아를 움직이지 않고 바늘이 압력을 가할 수 있도록 하는 지지대를 제공합니다. 바늘 끝이 단일 셀에 들어가면 페달을 밟아 원하는 양의 용액을 방출합니다. 모든 배아에 대해 이 과정을 반복합니다.
15. 완료되면 주입된 배아를 어류 시스템 물과 일회용 3.4mL 전달 피펫으로 아가로스 노치에서 헹구어 라벨이 부착된 접시에 옮깁니다. 배아를 28.5°C 인큐베이터에 보관하여 배아가 발달할 수 있도록 합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아가로스 RA	암레스코	N605-500지	주입 젤을 만들기를 위해
명시야 해부 범위	니콘	재질 보기 SMZ 745	Dechorionation, microinjection, 마운팅
일회용 전사 피펫 3.4 ml	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	오전 13-711-9시	물고기 배아와 물 이동
겸자 #5	WPI (영어)	500342	Dechorionation 및 바늘 깨짐
로딩 팁	에펜도르프	930001007	주사 용액을 capilary 바늘에 적재하기 위해
미세 사출 금형	적응형 과학 도구	TU-1	주입 중 어류 배아를 고정하기 위한 아가오르제 몰드 트레이를 준비하기 위해
마이크로인젝터	WPI (영어)	공압 피코 펌프 PV820	미세주입 인젝터
마이크로 매니퓰레이터	WPI (영어)	마이크로인젝터 MM3301R	미세 주입 작업
마이크로피펫 풀러	셔터 계기	P-1000	모세관 바늘 준비용
미네랄 오일	암레스코	J217-500ml	주입량 교정용
플라스틱 페트리 접시	폭스바겐	제25384-088	이미징 과정에서 물고기 또는 물고기 배아를 잡기 위해
스테이지 마이크로미터	Am 범위	MR100	미세주입 부피 교정
얇은 벽 유리 모세관	WPI (영어)	TW100F-4	생필 바늘을 만들기 위한 원료 유리

) 호 시리즈