인간 iPSC에서 PiggyBac Transposon-매개 유전자 편집: PiggyBac Transposon 시스템을 사용하여 인간 iPSC에 관심 유전자를 통합하는 절차

초록

출처: Garone, M. G. et al. PiggyBac 벡터를 사용하여 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC)를 기능적 척추 및 두개골 운동 뉴런으로 변환. J. Vis. 특급 (2019년)

이 비디오는 계통 특이적 전사 인자의 이소성 발현에 의해 PiggyBac 전이 시스템으로 인간 iPSC를 transfection하여 운동 뉴런을 생성하는 절차를 보여줍니다.

프로토콜

1. NIL 및 NIP 유도성 iPSC 라인 생성

1. 세포 transfection
   1. PBS(Ca²⁺/Mg²⁺ free)로 세포를 헹굽니다.
   2. 세포 해리 시약(재료 표 참조)(35mm 접시의 경우 0.35mL)을 추가하고 단일 세포가 100°C가 될 때까지 37°C에서 배양합니다.
   3. 분리(5-10분).
   4. P1000 피펫터로 위아래로 3-4회 피펫팅하여 세포 분리를 부드럽게 완료합니다.
   5. 15mL 튜브에 모으고 PBS(Ca^2+/Mg²⁺ free)를 10mL에 추가합니다. 세포를 세십시오.
   6. 10⁶ 세포를 펠렛화하고 100 μl의 Buffer R에 재현탁합니다(세포 electroporation 키트에 포함, 재료 표 참조).
   7. transfection을 위한 플라스미드 DNA 추가: 4.5 μg의 transposable vector(epB-Bsd-TT-NIL 또는 epB-Bsd-TT-NIP) 및 0.5 μg의 piggyBac transposase plasmid.
   8. 제조업체의 지침에 따라 1,200V 전압, 30ms 너비, 1펄스를 사용하여 셀 electroporation 시스템(재료 표 참조)과 교환합니다. 6mm 매트릭스 코팅 접시에 10μM Y-27632(ROCK 억제제, 재료 표 참조)가 보충된 인간 iPSC 배지에 세포를 파종합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
나27	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-093-566	신경 세포 유지를 위한 무혈청 보충제
뱀뱅커	Nippon Genetics (일본유전학)	NGE-BB02	운동 뉴런 전구세포를 위한 세포 동결 배지
염화칼슘2	시그마-알드리치	C3881	전기생리학적 용액을 위한 화학물질
코닝 Matrigel hESC 인증 매트릭스	코 닝	354277	Engelbreth-Holm-Swarm(EHS) 마우스 육종에서 재구성된 기저막 준비. 플라스틱 및 유리 지지체에 iPSC를 접착하는 데 사용됩니다
CRYOSTEM ACF 냉동 매체	생물 산업	05-710-1E	인간 iPSC를 위한 동결 매체
디스플레이	지브코	제17105-041	인간 iPSC의 부드러운 해리를 위한 시약
DMEM/F12	시그마-알드리치	D6421-500ML	세포 배양을 위한 기초 배지
독시사이클린	시그마-알드리치	D9891-1G	epB-Bsd-TT-NIL 및 epB-Bsd-TT-NIP 벡터에서 전이유전자 발현을 유도하는 데 사용됩니다.
DS2U	위셀	UWWC1-DS2U	상업용 인간 iPSC 라인
지그엔프	프리프로텍	450-10	신경교세포(glial-derived neurotrophic factor)
Gibco Episomal hiPSC 라인	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	A18945	상업용 인간 iPSC 라인
헤페스	시그마-알드리치	H4034	전기생리학적 용액을 위한 화학물질
라미닌	시그마-알드리치	11243217001	in vitro에서 신경 세포의 부착 및 성장 촉진
네아	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	11140035	비필수 아미노산. 세포 성장과 생존력을 높이기 위해 세포 배양 배지의 보충제로 사용됩니다.
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