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1. CRISPR-concatemer 벡터를 위한 gRNA 디자인
참고: 이 섹션의 목적은 최상의 타겟팅 전략을 선택하는 방법과 CRISPR-concatemer 벡터에 대한 특정 돌출부를 포함하는 gRNA를 설계하는 방법을 설명하는 것입니다.
- 선택한 CRISPR gRNA 디자인 도구를 사용하여 관심 유전자에 대한 gRNA를 설계합니다. 예제는 재료 표를 참조하십시오.
메모: 한 쌍의 paralogous 유전자를 표적으로 할 때, 유전자당 하나의 gRNA를 설계하는 것이 가능하더라도, 이중 knockout을 달성할 가능성을 높이기 위해 유전자당 두 개의 gRNA를 설계하는 것이 좋습니다(그림 1).
- 제한 매핑 도구를 사용하여 gRNA에 BbsI 인식 부위가 포함되어 있지 않은지 확인합니다(예시는 Table of Materials 참조).
- 표 1과 같이 각 올리고에 특정 CRISPR-concatemer 벡터 돌출부를 추가합니다.
2. CRISPR-concatemer Vector에 gRNA 클로닝
- 올리고의 인산화 및 어닐링
메모: 이 단계는 각 gRNA oligo에 대해 상단 및 하단 가닥을 어닐링하는 방법과 단일 반응에서 말단을 인산화하는 방법을 보여줍니다.
- 아래 지침에 따라 올리고를 인산화하고 얼음 위의 상단 및 하단 가닥을 어닐링하기 위한 반응 혼합물을 준비합니다.
메모: 모든 올리고는 하나의 반응으로 풀링될 수 있습니다. 예를 들어, 4개의 gRNA-concatemer 벡터의 경우 8개의 oligo를 함께 풀링합니다.
- 3개의 연결체의 경우, 3.0 μL gRNA 상단 가닥 (각 gRNA에서 1.0 μL; 10 μM, 1 μL/gRNA), 3.0 μL gRNA 하단 가닥 (각 gRNA에서 1.0 μL; 10 μM, 1 μL/gRNA), 2.0 μL T4 DNA 리가제 완충액 (10x), 1.0 μL T4 PNK를 사용하고, 총 부피 20.0 μL에 H2O를 추가합니다.
- 피펫팅으로 잘 섞고 다음 설정을 사용하여 열순환기에서 실행합니다: 37°C에서 30분, 95°C에서 5분, 0.3°C/분에서 25°C로 램프다운, 4°C에서 유지.
- BbsI 셔플 반응
메모: 이 섹션에서는 pre-annealed gRNA oligos가 digestion과 ligation의 주기를 번갈아 가며 한 단계로 concatemer 벡터의 적절한 위치에 통합됩니다.
- 반응 혼합물을 DNase/RNase가 없는 물에 1:100으로 희석하여 3 및 4 gRNA 연결체 벡터를 생성합니다.
메모: 2개의 gRNA-concatemer를 클로닝할 때는 이 단계가 필요하지 않습니다.
- 아래 지침에 따라 얼음 위에서 BbsI 셔플링 반응을 조립합니다. 벡터만 포함하는 음수 제어를 포함합니다.
- 100ng CRISPR-concatemer 벡터, 10.0μL 올리고 혼합물, 1.0μL BSA 함유 제한 효소 완충액(10x), 1.0μL DTT(10mM), 1.0μL ATP(10mM), 1.0μL BbsI, 1.0μL T7 리가아제 및 H2O를 총 부피 20.0μL까지 사용합니다.
- 피펫팅으로 잘 혼합하고 다음 설정을 사용하여 thermocycler에서 실행합니다: 3 및 4 gRNA concatemers 클로닝을 위해 50 사이클을 실행하고 2 gRNA concatemer를 위해 25 사이클을 실행하며, 둘 다 37 °C에서 5분 동안, 21 °C에서 5분 동안 유지하고, 37 °C에서 15 분 동안 유지한 다음 4 °C에서 영원히 실행합니다.
- 엑소뉴클레아제 치료
메모: 이 단계는 선형화된 DNA의 흔적을 제거하여 복제의 효율성을 높이므로 적극 권장됩니다.
- BbsI 셔플링 반응을 DNA 엑소뉴클레아제(Table of Materials) 참조)로 다음과 같이 처리한다.
- 이전 단계(2.2.3)에서 11.0 μL 결찰 혼합물을 취하여 1.5 μL 엑소뉴클레아제 완충액(10x), 1.5 μL ATP(10 mM), 1.0 μL DNA 엑소뉴클레아제를 첨가하고 물과 함께 총 부피를 15.0 μL로 올립니다. 37 ° C에서 30 분 동안 배양 한 다음 70 ° C에서 30 분 동안 배양합니다 .
메모: 이 단계는 혼합물에 남아 있는 선형화된 DNA를 제거하여 클로닝 효율을 높입니다.
- 열 충격에 의해 화학적으로 가능한 대장균 박테리아로 변형시키기 위해 반응 혼합물 2μL를 사용하십시오.
참고: 또는 반응을 -20°C에서 최대 1주일 동안 보관할 수 있습니다.
3. Electroporation에 의한 장 오가노이드의 형질 주입
참고: 이 절차는 2015년 Fujii 등이 발표한 프로토콜을 기반으로 하며, 마우스 소장 오가노이드 배양에 맞게 조정됩니다.
- 사전 electroporation
메모: 이 섹션에서는 배양 배지에서 모든 항생제와 컨디셔닝 배지를 제거하여 전기천공법 전에 마우스 장 오가노이드를 준비하는 방법에 대해 설명합니다. 이렇게 하면 전기천공법 중 발생할 수 있는 독성 효과를 방지할 수 있습니다.
- transfection 절차의 0일차에 오가노이드를 1:2 비율로 분할합니다.
참고: 장 오가노이드 배양은 이전에 확립된 프로토콜에 따라 crypt isolation을 수행하여 얻을 수 있습니다. 모든 미디어 구성에 대해서는 표 2를 참조하십시오.
- 전기천공을 위해 오가노이드를 분할할 때 transfection당 48웰 플레이트의 최소 6웰을 시딩합니다.
- 오가노이드를 20 μL-basement 매트릭스 방울에 파종하고 가습 인큐베이터에서 37 °C, 5 % CO2 (앞서 설명한 대로)에서 WENR + Nic 배지 (Wnt + EGF + Noggin + R-spondin + Nicotinamide)로 성장시킵니다.
- 2일차에 WENR+Nic을 항생제 없이 250μL의 EN(EGF + Noggin) + CHIR99021(Glycogen Synthase Kinase-3 억제제) + Y-27632(ROCK 억제제)로 대체하여 배지를 변경합니다(표 2 참조).
참고: 모든 단계에서 48웰 플레이트의 각 웰에 추가되는 배지의 양은 250μL입니다.
- 3일차에 오가노이드 배지를 항생제 없이 EN + CHIR99021 + Y-27632 + 1.25% v/v Dimethyl sulfoxide(DMSO)로 변경합니다.
- 세포의 준비
메모: 여기에서는 기계적, 화학적 해리를 통해 오가노이드를 작은 세포 클러스터로 단편화하는 방법을 설명합니다. 이러한 단계는 절차의 성공에 매우 중요합니다.
- 4일차에 1mL 피펫 팁을 사용하여 지하 매트릭스 돔을 파괴하고 오가노이드를 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 48웰 플레이트의 4웰의 내용물을 튜브에 풀링합니다.
- P200 피펫으로 약 200회 위아래로 피펫팅하여 오가노이드를 기계적으로 작은 조각으로 분해합니다. 실온에서 원심분리기, 600 x g에서 5분.
- 배지를 제거하고 펠릿을 1mL의 세포 배양 등급 재조합 프로테아제에 재현탁시킵니다(재료 표 참조). 37°C에서 최대 5분 동안 배양한 다음 4x objective.
를 사용하여 도립광 현미경으로 50μL 샘플 방울을 확인합니다.
메모: 10-15개의 세포로 구성된 클러스터가 바람직한데, 이는 전기천공법 후 세포 생존을 증가시키기 때문입니다.
- 세포 현탁액을 결합력이 낮은 15mL 튜브로 옮기고 항생제 없이 9mL의 기저 배지를 첨가하여 해리를 중단합니다(표 2 참조). 실온에서 600 x g에서 5분 동안 원심분리기를 한 다음 상등액을 버리고 펠릿을 1mL의 환원된 혈청 배지에 재현탁합니다(재료 표 참조).
- Bürker's chamber가 있는 세포의 수를 세고 전기천공 반응당 최소 1 x 105개의 세포를 사용합니다. 15mL 튜브에 9mL 환원 혈청 배지를 첨가하고 실온에서 400 x g에서 3분 동안 원심분리합니다.
- 전기천공법
메모: 다음 섹션에서는 전기천공법을 수행하는 방법과 나중에 오가노이드를 회복시키는 방법에 대한 지침을 제공합니다.
- 모든 상등액을 제거하고 펠릿을 전기천공법 용액에 재현탁합니다(재료 표 참조). 세포 현탁액에 총 10μg DNA를 추가하고 100μL의 최종 부피에 전기천공법을 첨가하고 세포-DNA 혼합물을 얼음 위에 유지합니다. CRISPR-concatamer 벡터를 Cas9 발현 플라스미드(예: Addgene #41815)와 1:1 비율로 사용합니다.
메모: 첨가된 DNA의 총 부피는 총 반응 부피의 10% 이하여야 합니다.
- 형질주입 효율을 평가하기 위해 GFP 플라스미드를 포함하는 별도의 형질주입 혼합물을 포함시킵니다(예: pCMV-GFP, Addgene #11153 또는 제네릭 GFP 발현 플라스미드).
- cell-DNA 혼합물을 electroporation 큐벳에 추가하고 electroporator 챔버에 넣습니다. electroporator의 해당 버튼을 눌러 임피던스를 측정하고 0.030-0.055kΩ인지 확인합니다. 표 3.
에 표시된 설정에 따라 electroporation을 수행합니다.
메모: 임피던스 값이 허용 범위를 벗어나면 큐벳에서 용액 부피를 조정하십시오.
- 큐벳에 400μL의 전기천공법 완충액 + Y-27632를 추가한 다음 모두 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 세포가 회복될 수 있도록 실온에서 30분 동안 배양한 후 실온에서 400 x g에서 3분 동안 회전시킵니다.
- 상층액을 제거하고 펠릿을 20 μL/웰의 지하 매트릭스에 재현탁합니다. 48웰 플레이트에 웰당 약 1 x 104 - 1 x 105 세포를 시딩하고 EN + CHIR99021 + Y-27632 + 1.25% v/v DMSO 배지를 추가합니다. 37 °C에서 배양합니다.
- 5일차에 배지를 EN + CHIR99021 + Y-27632로 변경하고 GFP 발현을 관찰하여 transfection efficiency를 확인합니다(그림 2). 오가노이드를 37°C로 유지하고 2일 후에 EN + CHIR99021 + Y-27632 배지를 새로 고칩니다.
- 9일차에 배지를 WENR + Nic + Y-27632로 변경하고 37°C에서 배양합니다.
메모: Y-27632는 7-10일 후(16-19일) 제거할 수 있습니다.
| 카세트 1 | 카세트 2 | 카세트 3 | 카세트 4 |
| 시퀀스(5'-3') | CACCGG[gRNA1]GT | ACCGG[gRNA2]지 | CCGG[gRNA3] | 아카그그[gRNA4]GTT |
| 시퀀스(5'-3') | 타아악[RC-gRNA1]CC | AAAAC[RC-gRNA2]씨 | AAAC[RC-gRNA3] | CTAAAAC[RC-gRNA4]CCG |
표 1: CRISPR-concatemer 벡터의 각 카세트에 대한 돌출부.
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| 기초 매체 | | 코멘트 |
| 4 °C에서 4 주 동안 보관하십시오 | | |
| 세포 배양 배지 | 500 밀리리터 | 재료 표 참조 |
| L-글루타민 | 100x 5 mL | |
| 버퍼링 제 1 M | 5 밀리리터 | 재료 표 참조 |
| 페니실린 스트렙토마이신 | 100x 5 mL | |
| WENR + Nic (Wnt + EGF + Noggin + Rspondin + 니코틴아미드) | | |
| 4 °C에서 2 주 동안 보관하십시오 | | |
| 기초 매체 | 최대 50 mL | |
| 신경 세포 무혈청 보충제(50개) | 1 mL | 재료 표 참조 |
| 뉴런 세포 무혈청 보충제(100개) | 500 마이크로L | 재료 표 참조 |
| n-아세틸시스테인(500mM) | 125 마이크로L | |
| 마우스 EGF (100 μg/mL) | 25 마이크로L | |
| 마우스 노긴 (100 μg / mL) | 50 마이크로L | |
| R-Spondin 컨디셔닝 배지 | 5 밀리리터 | |
| Wnt3a 컨디셔닝 배지 | 25 밀리리터 | |
| 니코틴아미드(1m) | 250 마이크로L | |
| EN + CHIR + Y-27632 (EGF + 노긴 + CHIR + Y-27632) | | |
| 4 °C에서 2 주 동안 보관하십시오 | | |
| 페니실린 스트렙토마이신이 없는 기초 배지 | 최대 20mL | |
| 신경 세포 무혈청 보충제(50개) | 400 μL | 재료 표 참조 |
| 뉴런 세포 무혈청 보충제(100개) | 200 마이크로L | 재료 표 참조 |
| n-아세틸시스테인(500mM) | 50 마이크로L | |
| 마우스 EGF (100 μg/mL) | 10 μL | |
| 마우스 노긴 (100 μg / mL) | 20 마이크로L | |
| Y-27632 (10 μM) | 20 마이크로L | |
| CHIR99021(8μM) | 10 μL | |
| EN (EGF + 노긴) | | |
| 4 °C에서 4 주 동안 보관하십시오 | | |
| 기초 매체 | 최대 50 mL | |
| 신경 세포 무혈청 보충제(50개) | 1 mL | 재료 표 참조 |
| 뉴런 세포 무혈청 보충제(100개) | 500 마이크로L | 재료 표 참조 |
| n-아세틸시스테인(500mM) | 125 마이크로L | |
| 마우스 EGF (100 μg/mL) | 25 마이크로L | |
| 마우스 노긴 (100 μg / mL) | 50 마이크로L | |
표 2: 오가노이드 배지 구성.
개
개
| 포링 펄스 | 전달 펄스 |
| 전압 | 175볼트 | 20볼트 |
| 펄스 길이 | 5밀리초 | 50밀리초 |
| 펄스 간격 | 50밀리초 | 50밀리초 |
| 펄스의 수 | 2 | 5 |
| 감쇠율 | 10% | 40% |
| 극성 | + | +/- |
표 3: Electroporation 조정.
