부착 배양 세포에 핵산을 도입하기 위한 비드 로딩: 부착 포유류 세포에 형광 단백질 인코딩 플라스미드를 적재하는 기술

초록

출처: Cialek, C. A. et al. 단백질과 핵산을 부착한 인간 세포에 비드 로딩. J. Vis. 특급 (2021).

이 비디오에서는 bead loading을 사용하여 부착 포유류 세포에 핵산을 도입하는 절차를 설명합니다.

프로토콜

1. 비드 로딩 셀

참고: 필요한 경우 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 잠시 세척한 다음 최적의 배지 2mL를 추가합니다. 최소 30분 동안 배양합니다.

1. 원하는 플라스미드, 단백질 및/또는 입자를 포함하는 3-8 μL의 용액을 만듭니다. 실험 요구 사항에 따라 각 유형의 플라스미드를 ~1 μg(0.1-1 pmol)과 단백질을 ~0.5 μg(0.01 nmol)을 사용합니다. 단백질에 저유지력 튜브를 사용하여 단백질이 튜브 벽에 남지 않도록 합니다. PBS를 사용하여 용액을 최소 3μL까지 가져오고 용액 부피를 조정하여 로드할 세포의 전체 영역(즉, 챔버의 마이크로웰, 그림 1B)을 코팅합니다.
2. 위아래로 피펫팅하거나 튜브를 튕겨 용액을 철저히 혼합합니다. 탁상용 마이크로퓨지에서 용액을 튜브 바닥까지 짧게 회전시킵니다.
3. bead loading solution과 세포 챔버를 조직 배양 후드로 옮깁니다. 멸균 기술을 사용하여 조직 배양 후드의 나머지 단계를 수행합니다.
4. 세포에서 배지를 제거하고 멸균 튜브에 임시로 보관합니다. 챔버 가장자리 주변에서 모든 매체를 부드럽게 흡입하고 챔버를 약 45° 각도로 기울이고 중앙 마이크로웰에 남아 있는 매체 방울을 제거합니다. 매체를 제거하는 동안 피펫 팁이 유리에 닿지 않도록 하여 세포가 벗겨지거나 손실되지 않도록 하십시오. 세포가 오랫동안 건조하지 않도록 다음 단계로 빠르게 이동합니다.
5. 비드 로딩 용액을 챔버 중앙의 유리 마이크로웰에 부드럽게 피펫팅합니다. 선택 사항: 챔버가 완전히 건조되지 않도록 ~30초 동안 부드럽게 흔들면서 배양합니다.
6. 세포 상단에 유리 구슬의 단층을 부드럽게 분산시키되, 가급적이면 비드 로딩 장치를 사용합니다(그림 1A). 비드가 유리 바닥 마이크로웰의 세포를 완전히 덮는지 확인합니다.
7. 두 손가락으로 챔버를 꼬집고 ~2인치를 들어 올려 단단히 내려 후드 표면에 두드립니다. 그 높이에서 접시를 떨어뜨리는 것과 거의 같은 힘을 사용하십시오. 총 ~10회 탭하는 동안 반복합니다.
   메모: 탭으로 인해 세포가 실질적으로 벗겨지지 않는지 확인하십시오. 태핑은 셀 유형에 맞게 최적화할 수 있습니다. 셀이 제대로 로드되지 않으면 더 세게 두드리십시오. 그러나 많은 세포가 벗겨지면 더 가볍게 두드리십시오.
8. 챔버의 플라스틱 면에 천천히 피펫팅하여 챔버에 매체를 부드럽게 다시 추가합니다. 세포를 방해하지 않고 떠다니는 구슬을 흡인하십시오. 너무 많이 제거된 경우 이 단계에서 예열된 미디어를 더 추가합니다. 인큐베이터에서 0.5-2시간 동안 세포를 배양합니다.

결과

그림 1: 비드 로딩 장치, 기술 및 타임라인

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10cm 세포 배양 접시	폭스바겐	82050-916	세포 배양에 사용
35mm 세포 배양 접시	송골매	353001	비드 로더를 구성하는 데 사용
Attofluor 세포 챔버	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	A7816	사용자 지정 비드 로더를 구성하는 데 사용합니다.
DMEM, 고포도당, 글루타민 무함유	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	11960069	일반 세포 배양에 사용
유리 바닥 접시, 35mm, # 1.5, 14mm 유리	MatTek 코퍼레이션	P35G-1.5-14-C	이미징을 위해 이 챔버에 세포를 시드합니다.
유리 구슬, 세척된 산, ≤106 μm	밀리포어 시그마	G4649 (영문	세포에 뿌려서 플라스미드 DNA와 단백질을 비드 로드
인산염 완충 식염수(PBS)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	AM9625	멸균 1X PBS의 작업 재고
페놀 프리 DMEM	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	31053036	이미징 전에 세포에 사용
Opti-MEM, 리즈드 세럼 미디엄	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	31985070	bead loading 전 세포 배양을 위한 최적의 배지(선택적 단계)

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