핵산 화물의 나노블레이드 기반 전달: 바이러스 유사 입자를 통해 Cas9-sgRNA 복합체를 표적 세포에 전달하는 기술

초록

출처: Mangeot, P. E., et al. 바이러스 유사 입자("나노블레이드")를 통해 불멸화 및 일차 세포에서 Cas9/sgRNA 리보핵단백질 복합체의 전달. J. Vis. 특급 (2021).

이 비디오는 게놈 편집을 위해 표적 세포 내에서 Cas9-sgRNA 리보핵단백질 복합체를 나노블레이드 기반으로 전달하는 기술을 보여줍니다. 나노블레이드는 바이러스와 유사한 입자로 증식하여 주변 세포를 감염시킬 수 있는 능력이 없기 때문에 바이오 및 나노 물질의 신속한 용량 의존적 수송에 매우 유용합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. sgRNA 설계 및 클로닝

참고: sgRNA 설계에 대한 지침은 https://blog.addgene.org/how-to-design-your-grna-for-crispr-genome-editing 또는 Hanna 및 Doench와 같은 여러 출처에서 얻을 수 있습니다.

1. 20개의 뉴클레오티드 sgRNA 염기서열이 설계되면 다음과 같은 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드를 주문합니다.
   1. 전방: 5' caccgNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3' (N은 PAM(protospacer-adjacent motif) 서열이 없는 표적 궤적에 해당)
   2. 역방향: 5' aaacNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNC 3' (N은 PAM 서열이 없는 표적 자리의 역보체에 해당)
      메모: 올리고뉴클레오티드를 주문할 때 특별한 수정이 필요하지 않습니다(5' 인산염에 대한 요구 사항 없음).
2. 5 μL의 어닐링 완충액 (500 mM NaCl; 100 mM Tris-HCl; 100 mM MgCl2; 10 mM DTT; 25 °C에 pH 7.9), 각 DNA 올리고뉴클레오티드 (물에 있는 100 μM 재고 해결책)의 1 μL 및 물의 42 μL를 섞어서 0.2 mL 폴리메라이제 연쇄 반응 (PCR) 관에 있는 2개의 DNA oligonucleotides를 혼성화하십시오.
3. PCR 블록에서 95°C에서 15초 동안 샘플을 배양한 다음 0.5°C/s의 램프로 온도를 20°C로 낮춥니다. 실온에서 보관하거나 -20°C에서 보관하십시오.
   메모: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
4. 총 반응량 50 μL.
   에서 10 단위의 BsmBI-v2 제한 효소와 10 단위의 BsmBI-v2 제한 효소로 10 μg의 BLADE 또는 SUPERBLADE sgRNA 발현 플라스미드를 분해합니다. 메모: 분해된 벡터는 ~1.9 kb의 DNA insert와 ~3.3 kb의 두 번째 DNA 단편을 방출해야 합니다.
5. 5 μg/mL의 에티듐 브로마이드(또는 더 안전한 대체 DNA 젤 염색제)로 염색된 1% 아가로스 겔에 제한 반응을 로드합니다.
   메모: 유전적 결함을 일으키는 것으로 의심되는 브롬화 에티듐을 조작할 때는 적절한 보호 장비를 착용하십시오.
   1. 312nm의 파장으로 설정된 자외선(UV) 테이블에서(DNA 손상을 방지하기 위해) 겔에서 3.3kb DNA 단편을 잘라내고 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다.
      알림: 브롬화 에티듐을 조작하고 UV 테이블에서 작업할 때 적절한 보호 장비(장갑 및 자외선 차단 고글)를 착용하십시오.
   2. 전용 DNA 겔 추출 키트를 사용하여 3.3kb DNA 단편이 포함된 슬라이스 겔에서 DNA를 추출합니다(재료 표 참조). 분광 광도계를 사용하여 정제된 DNA의 양을 정량화합니다.
      참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
6. 1.2단계의 하이브리드화된 forward 및 reverse DNA 올리고뉴클레오티드를 1.5.2단계의 BsmB1 분해, 겔 정제 BLADES 또는 SUPERBLADE 벡터로 접합합니다. 이를 위해 T4 DNA 리가제 완충액 2 μL, 겔 정제 벡터 50 ng(단계 1.5.2), 혼성화된 DNA 올리고뉴클레오티드 1 μL(단계 1.2), 부피를 19 μL로 구성하는 물, T4 DNA 리가제 1 μL를 추가합니다. 25°C에서 10분 동안 반응을 배양합니다.
   1. 결찰 산물을 유능한 박테리아로 전환시킵니다(재료 표 참조). 형질전환된 박테리아를 암피실린 Luria Bertani 한천 플레이트에 플레이트화하고 37°C에서 밤새 배양합니다.
   2. 한천 플레이트에서 여러 개의 분리된 콜로니를 선택하여 DNA minipreparation을 수행하고(Table of Materials) U6 forward primer(5' GACTATCATATGCTTACCGT 3')를 사용하여 Sanger 염기서열분석을 수행하여 sgRNA variable sequence의 올바른 ligation을 확인합니다.
      참고: 다른 sgRNA 발현 플라스미드는 Cas9 단백질을 암호화하지 않는 경우 사용할 수 있으며, 이는 Nanoblade 생산을 방해할 수 있습니다.

2. 플라스미드 준비

1. 필요한 모든 플라스미드의 maxipreparation(재료 표 참조)을 수행하고, -20 °C에서 보관하기 위해 1 μg/mL에서 10 μg 분취량을 준비합니다. 플라스미드의 반복적인 동결/해동 주기를 피하고, 폐기하기 전에 부분 표본을 두 번 사용합니다.

3. 나노 블레이드 준비

1. 1일차에 10cm 세포 배양 접시에 고포도당, 피루브산 나트륨, L-글루타민, 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 Dulbecco의 변형 이글 배지(DMEM) 10mL에 3.5 HEK293T× 4개 사이의 세포(재료 표 참조)를 파종합니다. 10cm 플레이트를 앞뒤로 부드럽게 움직인 다음 오른쪽에서 왼쪽으로(이 시퀀스를 5회 반복) 배양 접시 위에 세포를 균일하게 분포시킵니다. 37°C의 세포 배양기에서 5% CO₂.
   로 세포 배양 메모: 배양된 세포 및 나노블레이드의 취급과 관련된 모든 절차는 오염을 방지하기 위해 세포 배양 층류 후드 아래에서 수행해야 합니다.
2. 2일차: 플라스미드 형질주입
   1. 셀은 도금 후 24시간 후에 70-80% 융합되어야 합니다(그림 1A). transfection 전에 배지를 고포도당, 피루브산 나트륨, L-글루타민, 10% FBS(페니실린 및 스트렙토마이신은 필수는 아니지만 생략할 수 있음)를 함유한 신선한 DMEM 10mL로 교체하십시오.
      참고: 이 단계에서는 셀이 합류하지 않는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면 transfection 효율과 입자 생성이 감소할 수 있습니다.
   2. 각 10 cm 플레이트에 대해 1.5 mL 튜브에 0.3 μg pCMV-VSV-G, 0.7 μg pBaEVRless, 2.7 μg MLV Gag/Pol, 1.7 μg BIC-Gag-Cas9, 4.4 μg의 BLADES 또는 SUPERBLADES 플라스미드를
   준비합니다.
   3. 500μL의 형질주입 완충액(재료표 참조)을 추가하고 10초 동안 와류를 일으킨 다음 1초 동안 원심분리를 합니다. 20μL의 형질주입 시약(재료 표 참조)을 추가하고 1초 동안 튜브를 와류로 처리한 다음 1초 동안 원심분리를 합니다.
   4. 실온에서 10분 동안 배양하고 P1000 피펫터를 사용하여 전체 용액을 DMEM 배지의 세포에 적가합니다. 10cm 플레이트를 앞뒤로 부드럽게 움직인 다음 오른쪽에서 왼쪽으로(이 시퀀스를 5회 반복) transfection 시약을 세포 전체에 균일하게 분포시킵니다. 37°C에서 최소 40시간 동안 5% CO₂.
      의 세포 배양기에서 세포를 배양합니다. 메모: 원하는 경우, transfection 4시간 후에 배지를 변경할 수 있습니다.
3. 3일차에 현미경으로 형질주입된 세포의 형태를 확인합니다.
   메모: 생산자 셀이 융합하기 시작합니다. 이는 fusogenic 바이러스 외피의 발현으로 인해 발생하는 정상적인 현상입니다(그림 1B, C).
4. 4일차: 나노블레이드 수확하기
   메모: 형질주입 후 최소 40시간이 지나면 퓨저겐 바이러스 외피의 발현으로 인해 세포가 서로 융합되었을 것이며, 때로는 세포가 플레이트 지지체에서 완전히 분리되었습니다(그림 1D).
   1. 10mL 피펫을 사용하여 9mL의 배양 배지 상등액을 수집합니다.
      메모: 나노블레이드는 Cas9 단백질 및 관련 sgRNA를 일차 세포 및 생체 내에서 전달할 수 있는 VLP입니다. 유전 물질이 없기 때문에 유전자 변형 유기체로 간주되지는 않지만 유전적 변화를 유발할 수 있습니다. 따라서 사용자와의 접촉을 피하기 위해 주의해서 조작해야 합니다(특히 종양 억제 유전자를 표적으로 하도록 프로그래밍된 경우). 사용자는 레트로바이러스 벡터의 조작에 대한 현지 안전 지침을 따르고 VLP를 준비하고 형질도입 실험을 수행할 때 BSL-2 수준의 실험실에서 작업하는 것이 좋습니다. 나노 블레이드는 70 % 에탄올 또는 0.5 %의 차아 염소산나트륨으로 비활성화 할 수 있습니다. 또한 모든 플라스틱 폐기물(피펫 팁, 조직 배양 플레이트, 원심분리 튜브)을 0.5% 차아염소산나트륨으로 최소 10분 동안 처리하여 나노블레이드를 비활성화하는 것이 좋습니다.
   2. 수집된 상층액을 500 × g에서 5분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거하고 세포 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 회수합니다.
      참고: 나노블레이드를 일차 세포에 사용하는 경우 0.45μm 또는 0.8μm 필터를 사용하여 상층액을 필터링합니다. 이 단계는 나노블레이드 역가를 크게 감소시키므로 필터 멤브레인에서 상당한 부분이 차단된다는 점에 유의하십시오.
   3. 4,300 × g의 스윙 버킷 로터 또는 209,490 × g의 나노 블레이드를 4 ° C에서 75 분 동안 4 일 동안 펠렛 (12-16 시간) 펠릿 (재료 표 참조).
      참고: 표적 세포가 DMEM에서 성장할 수 있는 경우, 나노블레이드를 농축하지 않고 3.4.2단계 이후에 얻은 상층액으로 직접 배양할 수 있습니다.
5. 5일차: 나노블레이드의 재현탁 및 보관
   1. 원심분리 후 배지를 천천히 흡인하고 100μL의 차가운 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 흰색 펠릿을 재현탁합니다. 튜브를 파라필름으로 덮고 4°C에서 1시간 동안 부드럽게 교반한 후 위아래로 피펫팅하여 펠릿을 다시 현탁시킵니다.
      메모: 재현탁 시 흰색 점성 물질이 나타날 수 있습니다. 이는 정상이며 형질도입의 효율성에 큰 영향을 미치지 않습니다.
   2. 나노블레이드를 4주 이내에 사용할 계획이라면 4°C에서 보관하십시오. 그렇지 않으면 나노 블레이드를 액체 질소에 급속 동결하고 -80 ° C에서 보관하십시오 .
      알림: 액체 질소를 조작할 때는 보호 고글과 극저온 장갑을 착용하십시오. -80°C에서 급속 동결 및 보관하면 나노블레이드 효율이 크게 감소합니다. 또한 해동된 나노블레이드는 다시 얼려서는 안 됩니다. 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.

4. 자당 쿠션에 대한 나노 블레이드의 농도

참고: 야간 원심분리 또는 초원심분리(단계 3.4.3)의 대안으로 Nanoblades는 자당 쿠션에 농축될 수 있습니다. 이것은 더 순수한 나노 블레이드를 생성하지만 회수되는 총량은 더 적을 것입니다.

1. 1x PBS에서 10% 자당 용액(중량 대 부피)을 준비하고 0.2μm 주사기 필터를 통해 여과합니다(재료 표 참조).
2. 나노블레이드를 자당 쿠션에 농축하는 과정을 시작합니다.
   1. VLP 함유 샘플 9mL(3.4.3단계)를 초원심분리 튜브에 넣습니다(재료 표 참조). 3mL 주사기와 캐뉼라를 사용하여 VLP 함유 샘플과 자당 용액을 혼합하지 않도록 샘플 아래에 2.5mL의 10% 자당을 천천히 층을 이룹니다.
   2. 또는 10% 자당 2.5mL를 초원심분리 튜브에 넣습니다(재료 표 참조). 튜브를 기울이고 저속 피펫터로 9mL의 VLP 함유 샘플(3.4.3단계 참조)을 천천히 추가합니다. 이 작업 중에 튜브를 수직 위치로 점진적으로 올립니다.
3. 초원심분리기에서 209,490 × g의 시료를 4°C에서 90분 동안 원심분리합니다.
   메모: 이 기술은 하룻밤 사이에 저속 원심분리(4,300 × g)에 적용할 수 있습니다.
4. 원심분리 후 상층액을 조심스럽게 제거하고 튜브를 티슈 페이퍼 위에 거꾸로 올려 남아 있는 액체를 제거합니다. 1분 후 1x PBS 100μL를 추가하고 파라필름 커버를 사용하여 튜브를 교반 테이블의 튜브 홀더에 1시간 동안 놓고(재료 표 참조) 위아래로 피펫팅하여 펠릿을 다시 현탁시킵니다.
   참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.

5. dot-blot으로 Nanoblades 내에서 Cas9 로딩 모니터링

4부피의
1. 1x PBS에 비이온 계면활성제(Table of Materials) 1부피를 첨가하여 희석 완충액을 준비합니다. 2μL의 농축된 나노블레이드를 50μL의 희석 완충액에 희석하고 잠시 와류를 일으킨 다음 이 혼합물 25μL를 25μL의 희석 완충액이 들어 있는 새 튜브로 옮깁니다. 이 작업을 반복하여 4개의 Nanoblade 희석 튜브를 만듭니다(2배 희석 단계).
2. 표준 대조군의 경우, 2μL의 재조합 Cas9 뉴클레아제(재료표 참조)를 50μL의 희석 완충액에 희석하고 간단히 와류를 일으킨 다음 8개의 연속 희석(각 단계당 2배 희석)을 진행합니다.
3. 멀티채널 피펫을 사용하여 각 VLP 희석액 2.5 μL와 각 표준물질 2.5 μL를 니트로셀룰로오스 멤브레인에 조심스럽게 찾아냅니다(부피가 클면 스폿이 겹칠 수 있음).
   메모: 메탄올 처리된 폴리불화비닐막도 사용할 수 있습니다.
4. 입자가 멤브레인에 흡수되면 실온에서 1분 동안 무지방 분유(5% w/v)가 보충된 비이온 계면활성제(TBS-T)가 포함된 5x Tris-buffered saline으로 멤브레인을 차단합니다.
   메모: 여기서 프로토콜을 일시 중지할 수 있으며 멤브레인은 1x TBS-T에서 4°C로 보관됩니다.
5. 무지방 분유가 보충된 1x TBST를 버리고 Cas9-horseradish peroxidase 항체(1x TBST에 1/1000 희석, 5% 우유)로 4°C에서 밤새 멤브레인을 배양합니다. TBS-T로 멤브레인을 3x 세척하고 향상된 화학발광 기질 키트를 사용하여 신호를 시각화합니다.
6. 겔 이미징 스테이션 또는 imageJ와 함께 제공되는 독점 소프트웨어를 사용하여 Nanoblades 및 재조합 Cas9 표준 희석액의 도트 강도를 정량화합니다. 도트 강도를 Cas9 농도에 연결하는 선형 곡선을 정의합니다. 얻어진 곡선의 함수를 사용하여 각 준비의 Cas9 함량을 외삽합니다.
   메모: 재조합 Cas9 단백질 제어의 양은 표준 희석 세트의 가장 농축된 샘플에 대한 판독값을 포화시킬 수 있습니다(그림 2). 따라서 선형 곡선을 정의할 때 희석되지 않은 샘플(때로는 첫 번째 희석 단계의 판독값)이 발견된 Cas9의 알려진 농도와 관련하여 선형 범위에 있지 않은 경우 판독값을 제거하는 것이 좋습니다. 마찬가지로, Nanoblade 샘플 내의 Cas9 양을 외삽할 때는 표준 곡선의 선형 범위 내에 있는 판독값만 사용합니다.

6. Nanoblades를 이용한 타겟 세포의 형질도입(12-well plate에서의 형질주입 절차)

1. 12웰 플레이트에서 웰당 100,000-200,000개의 세포(1차 또는 불멸화된 부착 세포)를 적절한 세포 배양 배지 1mL에 시딩합니다. 형질도입 전에 세포가 플레이트 표면에 부착되도록 합니다.
2. 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 5-20μL의 농축 나노블레이드(3.5.1 또는 4.4단계 기준)를 500μL의 세포 배양 배지에 첨가하고 P1000 피펫터로 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 세포에서 배지를 제거하고 이 Nanoblade 혼합물 500μL로 교체하십시오.
   메모: 형질도입은 각 세포 유형에 맞게 최적화되어야 합니다. 나노블레이드가 고농축 상태를 유지할 수 있도록 가능한 가장 작은 부피의 배지를 사용하는 것이 중요합니다(표적 세포의 건조를 피하면서). 부착 세포는 플레이트에 부착된 상태에서 직접 형질도입되어야 합니다(현탁액에서는 형질도입 효율을 크게 감소시키므로 현탁액에서 형질주입하지 마십시오). 일부 세포는 나노 블레이드에 장기간 노출(24-48시간)을 견디는 반면 다른 세포는 매우 민감하여 작은 세포융합을 형성할 수 있습니다. 이 경우, 나노 블레이드는 배지를 교체하기 전에 4-6 시간 동안 만 세포와 함께 배양해야합니다. 척추 접종은 또한 현탁액에서 성장한 세포에 대한 transduction을 개선할 수 있습니다. 양이온성 폴리머(Table of Materials) 와 같은 보조제도 일부 세포 유형에서 transduction efficiency를 향상시킬 수 있습니다.
3. Nanoblades를 함유한 소량의 배지에서 4-6시간의 세포 배양 후 배지의 부피를 정상(12웰 플레이트로 작업하는 경우 1mL)으로 늘리거나 세포가 VLP에 민감한 경우 새 배지로 교체합니다.
   메모: Nanoblades를 포함하는 세포 배지는 폐기하기 전에 0.5% 차아염소산나트륨으로 10분 동안 비활성화해야 합니다. 차아염소산나트륨을 조작할 때는 장갑과 보호용 고글을 사용하십시오. 나노블레이드가 세포 사멸을 유도하는 경우 세포 사멸을 줄이기 위해 노출량과 총 노출 시간을 조정하십시오.

결과

그림 1: Nanoblade 생산 중 생산자 세포의 형태.(A) 도금 후 24시간 동안 70-80% 합류점에서 세포를 HEK293T. (B 및 C) 형질주입 후 24시간 후에 세포 형태를 HEK293T. (D) 형질주입 40시간 후 세포 형태를 HEK293T. 스케일 바 = 400μm.

그림 2: dot-blot에 의한 Nanoblades 내 C...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
13.2 mL, Thinwall 폴리프로필렌 튜브, 14 x 89 mm - 50Pk	벡크만쿨터 생명과학	331372	Nanoblades 정제를 위한 초원심분리 튜브
Amersham Protran 프리미엄 웨스턴 블로팅 멤브레인, 니트로셀룰로오스	머 크	GE10600004	정제된 나노블레이드 내에서 Cas9 수준을 정량화하기 위한 니트로셀룰로오스 멤브레인
빅-개그-CAS9	애드진	119942	GAG(F-MLV)-CAS9(SP) 융합을 인코딩합니다. 과발현된 gRNA 및 적절한 외피와 관련하여 생산자 세포의 입자와 같은 GAG-CAS9 바이러스를 생산할 수 있습니다.
BICstim-개그-dCAS9-VPR	애드진	120922	표적 전사 활성화를 위해 GAG-dCAS9-VPR 융합을 인코딩
잎	애드진	134912	Nanoblades 시스템에서 사용할 sgRNA 염기서열 클로닝을 위한 빈 백본
BsmBI-v2	뉴잉글랜드 바이오랩스	R0739S	sgRNA 클로닝을 위해 BLADE 및 SUPERBLADES 벡터를 분해하기 위한 제한 효소
Cas9(7A9-3A3) 마우스 mAb(HRP 접합체) #97982	세포 신호 전달 기술	97982에스	dot-blot에 의한 Cas9 정량화를 위한 Anti-Cas9 항체
Cas9 뉴클레아제, S. 화농성	뉴잉글랜드 바이오랩스	M0386T	재조합 Cas9 단백질은 Nanoblades 내에 적재된 Cas9의 양에 대한 절대 정량화를 위한 기준으로 사용됩니다.
에티듐 브로마이드 용액 (H2O에서 10 mg/mL)	시그마-알드리치	E1510-10ML	아가로스 겔 염색 및 DNA 시각화
Fisherbrand 웨이브 모션 쉐이커	피셔 사이언티픽	88-861-028	원심분리 시 나노블레이드를 재현탁시키기 위한 교반 테이블
겔분석기			http://www.gelanalyzer.com; Digestion 후 Band intensity 정량화
게시클 프로듀서 293T	다카라	632617	나노블레이드 생산자 세포주
Gibco DMEM, 고포도당, 피루브산	써모피셔 사이언티픽	41966052	Gesicle Producer 293T 세포를 위한 세포 배양 배지
DNA 및 DNA/siRNA용 jetPRIME Transfection 시약 키트	폴리플러스	폴114-15	Gesicle Producer 293T 세포에서 나노블레이드 생산을 위한 트랜스펙션 시약
Millex-AA, 0.80 μm, 주사기 필터	밀리포어	SLAA033SS	나노블레이드가 농축되기 전에 세포 파편을 제거하는 주사기 필터
Millex-GS, 0.22 μm, 주사기 필터	밀리포어	SLGS033SS	자당 쿠션 용액을 살균하는 주사기 필터
Millex-HP, 0.45 μm, 폴리에테르설폰, 주사기 필터	밀리포어	SLHP033RS	Nanoblades 농축 전에 세포 파편을 제거하는 주사기 필터
Monarch DNA 겔 추출 키트	뉴잉글랜드 바이오랩스	T1020엘	BsmBI로 분해 시 pBLADES 또는 pSUPERBLADES 플라스미드 단편 정제를 위한 DNA 겔 추출 키트
NEB Stable Competent E. coli (고효율)	뉴잉글랜드 바이오랩스	C3040I는	플라스미드 형질전환 및 증폭을 위한 유능한 박테리아
트랜스펙션 등급 플라스미드 DNA를 위한 NucleoBond Xtra Midi 키트	마셰리-나겔	740410.5	배양된 박테리아에서 플라스미드 DNA를 정제하기 위한 Maxipreparation 키트
뉴클레오스핀 gDNA 추출 키트	마셰리-나겔	제740952.5	형질도입된 세포에서 게놈 DNA 추출
NucleoSpin Plasmid, 플라스미드 DNA용 미니 키트	마셰리-나겔	740588.5	배양된 박테리아에서 플라스미드 DNA를 정제하기 위한 Minipreparation Kit
NucleoSpin Tissue, 세포 및 조직의 DNA를 위한 미니 키트	마셰리-나겔	제740952.5	게놈 DNA 추출 키트
옵티마 XE-90	벡크만쿨터 생명과학	A94471	초원심분리기
pBaEVRless	엘스 베르호옌 (Inserm U1111)	Personnal 요청은 다음 주소로 보내야 합니다 els.verhoyen@ens-lyon.fr	Girard-Gagnepain, A. et al. Baboon envelope pseudotyped LVs는 초기 사이토카인 자극 및 휴지 HSC로의 유전자 전달에 있어 VSV-G-LV보다 성능이 우수합니다. Blood 124, 1221–1231 (2014)
pBS-CMV-가그폴	애드진	35614	쥐 백혈병 바이러스 개그와 pol 유전자를 Enocdes
pCMV-VSV-지	애드진	8454	렌티바이러스 및 MuLV 레트로바이러스 입자를 생성하기 위한 외피 단백질
인산염 완충 식염수(PBS)	써모피셔 사이언티픽	14200091	밀리포어 물에 희석하는 10X PBS
폴리브렌 트랜스펙션 시약	밀리포어 시그마	TR-1003-G	특정 포유류 세포에서 레트로바이러스 형질도입의 효율성을 향상시키는 양이온성 고분자. 또한 상동성 유도 복구를 위해 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)의 바이러스 의존성 진입을 허용할 수 있습니다
자당, 분자 생물학, ≥99.5%(GC)	시그마-알드리치	S0389-5KG	초원심분리를 통한 나노블레이드 정제를 위한 쿠션을 준비하기 위한 설탕
SUPERBLADE5	애드진	134913	나노블레이드 시스템에 사용되는 sgRNA 염기서열 클로닝을 위한 빈 백본 (Chen B et al., 2013을 통해 게놈 편집 효율 향상을 위해 최적화)
SuperSignal West Dura 확장 기간 기판	써모피셔 사이언티픽	34076	Cas9 도트 블롯을 위한 향상된 화학발광(ECL) HRP 기판
SW 41 Ti 스윙 버켓 로터	벡크만쿨터 생명과학	331362	초원심분리용 로터
SYBR 안전한 DNA 젤 얼룩	써모피셔 사이언티픽	S33102 (영어	아가로스 겔 염색 및 DNA 시각화를 위한 에티듐 브로마이드의 대안
T4 DNA 리가아제	뉴잉글랜드 바이오랩스	M0202S	sgRNA의 가변 영역에 해당하는 duplexed DNA oligos로 BLADE 또는 SUPERBLADES 벡터를 접합하는 DNA ligase
트리톤 함유 용해 완충액	프로메가	E291A를 참조하십시오.	나노블레이드를 방해하고 Cas9 정량화를 허용하는 용해 완충액
트웬 20	시그마-알드리치	P9416	TBST의 준비를 위해

합니다. 호 호 년 ) (영문)