방법 논문

모기 배아 미세주입: 생식세포 돌연변이를 생성하기 위해 Anopheles gambiae의 배아 난황에 외인성 DNA를 전달하는 기술

2025년 7월 8일

이 논문에서

초록

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출처: Carballar-Lejarazú, R. et al, Anopheles gambiae 배아의 미세주입 방법. J. Vis. 특급. (2021).

이 비디오에서는 배아 미세주입 기술을 통해 Anopheles gambiae 모기의 배아에 유전자 드라이브 구조를 전달하는 방법을 보여줍니다. 이 절차를 통해 상동 재조합을 통해 전달된 DNA 구조를 생식세포 세포에 통합하여 형질전환된 모기 개체군을 생성할 수 있습니다.

프로토콜

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1. 배아 미세주입

  1. 마이크로 로더 팁을 사용하여 바늘에 2μL의 DNA 혼합물(300-400ng/μL 농도의 플라스미드 DNA)을 채웁니다. 바늘을 바늘 홀더에 삽입하고 자동 압력 펌프 튜브를 연결합니다(그림 1).
  2. 중요: 바늘이 슬라이드 평면과 15° 각도가 되도록 정렬합니다(그림 1).
  3. Anopheles gambiae 모기의 첫 번째 알을 조심스럽게 만져 바늘 끝을 열고 바늘 끝을 뒤쪽 극에 10μm ≤ 삽입하여 주입합니다. 성공적인 주입은 난자 내 세포질의 작은 움직임으로 이어질 것입니다.
  4. 현미경 동축 스테이지 컨트롤을 사용하여 다음 난자로 이동하여 주입을 계속합니다.
    1. 바늘 끝이 열린 상태로 유지되고 막히지 않았는지 확인하려면 다른 배아에 들어가기 전에 주입 버튼을 누르고 바늘 입구에 있는 작은 방울을 시각화합니다.
    2. 바늘이 막히면 지우기 버튼을 눌러 바늘을 지우고 액적 시각화 테스트를 반복합니다. 바늘 끝 구멍이 약간 커지면 필요에 따라 압력을 조정하여 액적의 크기가 작게 유지되도록 합니다.
    3. 바늘 하나로 ~40-50개의 달걀을 주입합니다.
      메모: 여과지가 항상 촉촉한 상태를 유지하는지 확인하십시오. 바늘을 깨끗하게 유지하기 위해 바늘에 충분한 배압을 유지하십시오. 막히지 않은 바늘은 새 바늘로 교체해야 합니다. 배아 배치, 바늘 삽입 및 주입은 스테이지의 수평 이동을 위한 동축 제어 장치가 있는 현미경을 사용하여 더 쉽게 수행할 수 있습니다(그림 2).
  5. 주사가 완료된 후 여과지를 깐 유리 용기에 난자를 헹구고 50mL의 탈이온화 H2O를 채웁니다(그림 3).
    메모: 배아는 주입 후 2일 후에 부화를 시작하며 3-5일이 걸릴 수 있습니다. 부화한 첫 번째 instar 유충은 즉시 (매일 2회 확인) 물과 음식이 담긴 깨끗한 용기로 옮겨야 합니다.

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결과

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그림 1: 미세주입 중 바늘 위치. A) 사출 단계의 광각 보기. B,C) 정렬된 배아가 주사 바늘과 15° 각도를 형성하도록 바늘을 배치합니다. 바늘을 현미경 단계보다 훨씬 높게 잡고 있는 미세 주입 도구의 팔을 올리지 마십시오.tage 바늘과 배아가 들어 있는 슬라이드 사이의 적절한 각도를 보장합니다.

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그림 2: 동축 컨트롤 및 바늘 홀더. A) 동축 컨트롤(화살표)은 바늘의 3차원 이동을 허용하여...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
선언된 이해 상충이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10x 미세주입 버퍼--1mM NaHPO4 완충액, pH 6.8, 50mM KCl
블로팅 멤브레인(Zeta-Probe GT 게놈 테스트 블로팅 멤브레인)바이오 라드깔끔하고 똑바로 2x1cm 조각으로 자릅니다
탈이온수 또는 이중 증류수(ddH20)밀리큐세척 병에
해부 현미경라이카라이카 MZ12배아 정렬을 위해
유리 용기파이렉스번호 3140125 엑스 65
유리 슬라이드피셔 브랜드번호 12-549-375x26 밀리미터
마이크로인젝터셔터 계기XenoWorks 디지털 마이크로인젝터
Microloader 피펫 팁에펜도르프20μL 마이크로로더 epT.I.P.S.
마이크로 매니퓰레이터셔터 계기XenoWorks 마이크로 매니퓰레이터
마이크로피펫라이닌20 마이크로L
현미경라이카DM 1000 LED 또는 M165 FC미세주입용
나일론 메쉬
페인트 브러시블릭제05831-7040호벌금, 크기 4/0
페트리 접시플라스틱, (60x15mm, 90x15mm)
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재인쇄 및 허가

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태그

DNA

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