유체역학적 유전자 전달: 꼬리 정맥 주입을 통한 쥐 간세포에서 외인성 DNA의 생체 내 형질 주입 기술

초록

출처: Hubner, E. K. et al., 유체역학적 꼬리 정맥 주입을 사용한 마우스 간세포의 유전적 생체 내 변형을 위한 구성 및 유도 시스템. J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오는 유체역학적 꼬리 정맥 주입에 의한 쥐 간세포의 유전적 생체 내 형질 주입 기술을 설명합니다. 이 transfection system은 간세포에서 transgene의 장기 발현을 생성합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 유체역학적 꼬리 정맥 주입을 위한 용액 준비

참고: 유능한 박테리아를 이용한 클로닝 기술을 통해 구성적이고 유도 가능한 유전자 발현을 위한 플라스미드 구조를 준비합니다.

1. 주사를 위해 멸균 0.9% 식염수를 준비합니다(PBS를 사용하지 마십시오). 마우스 체중의 약 10%에 해당하는 부피를 사용하십시오. 예: 무게가 20g인 마우스의 경우 2mL의 용액을 준비합니다.
2. endotoxin-free plasmid purification kit를 사용하여 정제된 주입 벡터를 준비합니다.
3. 10 μg 또는 15 μg의 내독소가 없는 수면 미용 벡터 구축물(10 μg 사용, 4단계에서 각각 15 μg 사용) 및 멸균 식염수 mL당 1 μg의 내독소가 없는 pc-HSB5를 추가합니다.
4. 4°C에서 최대 4시간 동안 용액을 보관하십시오. 얼리지 마십시오.

2. 유체역학적 꼬리 정맥 주입 수행

1. 꼬리 정맥 주사를 위해 억제기를 사용하십시오(시판용 또는 호흡 및 꼬리용 구멍이 있는 50mL 원추형 튜브로 준비). 튜브 바닥을 티슈 페이퍼로 채웁니다.
2. 주사의 경우 체중이 20-25g인 약 8-10주 된 마우스를 사용하십시오.
3. 주사 전에 마우스의 무게를 측정하고 체중(체중의 10%에 해당)에 따라 주사량을 준비합니다. 주입을 위해 27G 바늘이 있는 멸균 3mL 주사기를 준비하고 필요한 부피를 채웁니다.
4. 마우스를 고정장치에 넣습니다. 티슈 페이퍼의 양을 조정하여 움직일 수 있는 최소한의 공간만 남기고 숨을 쉴 수 있는 충분한 공간을 남겨둡니다.
5. 마우스가 규칙적으로 호흡하고 있는지 확인하십시오.
6. 적외선을 사용하여 꼬리를 따뜻하게하십시오.amp 30-60 초 동안. 과열의 징후가 있는지 주의 깊게 관찰하십시오.
7. 알코올 면봉으로 꼬리를 청소하십시오.
8. 꼬리 기저부에 가까운 두 개의 측면 꼬리 정맥 중 하나에 바늘을 거의 수평으로 삽입합니다.
   메모: 성공적으로 삽입되면 소량의 혈액이 바늘의 원뿔로 역류할 수 있습니다. 바늘을 추가로 움직이면 바늘이 변위 및/또는 정맥 손상이 발생할 수 있으므로 적극적으로 흡인하는 것은 권장하지 않습니다.
9. 8-10초 이내에 꼬리 정맥에 총 부피를 주입합니다.
10. 즉시 구속기에서 마우스를 제거하십시오. 최소 30초 동안 또는 출혈이 가라앉을 때까지 주사 상처를 압박합니다.
11. 마우스를 별도의 케이지에 넣습니다. 마우스가 절차에서 회복되면(약 30-60분) 마우스를 원래 케이지로 다시 옮깁니다. 다음 24시간 동안 정기적으로 마우스를 확인하십시오.
    메모: 마우스의 가벼운 진정은 주사 후 최대 2시간 동안 일상적으로 관찰됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
염화나트륨 0,9%	브라운	3200905	정맥 주사용 캐리어
팔콘 원뿔형 튜브 50ml	코닝 생명과학	352095
적외선 램프	해당 사항 없음	해당 사항 없음	쥐 꼬리의 온난화를 위해
HTVI를 위한 잠자는 숲속의 미녀-트랜스포손 벡터의 복제를 위한 플라스미드.
폴리에틸렌	해당 없음		구성적 유전자 발현을 위한 벡터
pEN_TTmcs	애드진	#의 25755	유도성 유전자 발현을 위한 엔트리 벡터
pEN_TTGmiRc2	애드진	#의 25753	GFP의 coexpression을 이용한 유도성 miRshRNA 발현을 위한 엔트리 벡터
pEN_TTmiRc2	애드진	#의 25752	GFP의 coexpression이 없는 유도성 miRshRNA 발현을 위한 진입 벡터
pTC 아포E-텟	애드진	#85578	ApoE.HCR.hAAT promotor를 이용한 유도성 유전자 또는 miR-shRNA 발현을 위한 발현 벡터
PTC-CMV-텟	애드진	#85577	CMV promotor를 이용한 유도성 유전자 또는 miR-shRNA 발현을 위한 발현 벡터