Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation: 유전자 조작 Agrobacterium tumefaciens를 통해 쌀 게놈을 유전적으로 변형시키는 방법

초록

출처: Xu, D., et al. Agrobacterium 매개 유전자 변형, 형질전환 생산 및 쌀의 남성 생식 발달 연구를 위한 응용. J. Vis. 특급 (2020).

이 비디오에서는 Agrobacterium tumefaciens 이진 벡터를 사용하여 쌀 게놈의 유전적 변형을 보여줍니다. 이 박테리아는 아그로박테리움(Agrobacterium) 독성 단백질을 사용하여 외부 DNA 플라스미드의 전달을 촉진합니다.

프로토콜

1. 쌀 유전자 형질전환 및 식물 조직 배양

1. 굳은살 유도 및 재생
   메모: 굳은살을 유도하기 위한 시작 물질로 신선한 어린 쌀 꽃차례를 사용합니다(그림 1).
   1. 감수 분열 단계에서 논이나 온실에서 어린 꽃차례를 수집하며, 1.6-4.8mm의 작은 꽃 길이로 결정됩니다 (그림 1A). 벼꽃차례가 잎칼집으로 덮여 있는지 확인하십시오. 70% 알코올 면봉으로 각 꽃차례를 닦고 자르기 전에 말리십시오.
   2. 꽃차례를 깨끗하고 멸균 벤치로 가져옵니다. 멸균된 가위로 작은 조각으로(작을수록 좋음) 절단을 NBD2 매체가 들어 있는 페트리 플레이트로 옮깁니다(그림 1B, 표 1).
   3. 굳은살을 유도하기 위해 약 10-14일 동안 26°C의 어두운 곳에서 플레이트를 배양합니다(그림 2A).
      메모: Agrobacterium 침투를 위해 새로 형성된 굳은살을 직접 사용하거나(1.2.7단계) 새로운 NBD2 배지에서 한 번 더 수리하여 더 많은 굳은살을 얻습니다. 8-10일마다 굳은살을 새로....

결과

그림 1 : 굳은살 유도를 위한 출발 물질. (A) 감수 분열 단계에서 어린 쌀 꽃차례. (B) NBD2 배지에서 자라는 어린 꽃차례를 해부했습니다. 막대 = 2cm(A).

그림 2 : Agrobacterium-mediated transformation에 의한 형질전환 세포주를 생산하는 절차. (A) 어린 꽃차례에서 생성된 쌀 칼리. (B) 칼리의 하위 문화. (C) A. tumefaciens를 사용한 calli의 배양. (D) .......