Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation: 유전자 조작 Agrobacterium tumefaciens를 통해 쌀 게놈을 유전적으로 변형시키는 방법

초록

출처: Xu, D., et al. Agrobacterium 매개 유전자 변형, 형질전환 생산 및 쌀의 남성 생식 발달 연구를 위한 응용. J. Vis. 특급 (2020).

이 비디오에서는 Agrobacterium tumefaciens 이진 벡터를 사용하여 쌀 게놈의 유전적 변형을 보여줍니다. 이 박테리아는 아그로박테리움(Agrobacterium) 독성 단백질을 사용하여 외부 DNA 플라스미드의 전달을 촉진합니다.

프로토콜

1. 쌀 유전자 형질전환 및 식물 조직 배양

1. 굳은살 유도 및 재생
   메모: 굳은살을 유도하기 위한 시작 물질로 신선한 어린 쌀 꽃차례를 사용합니다(그림 1).
   1. 감수 분열 단계에서 논이나 온실에서 어린 꽃차례를 수집하며, 1.6-4.8mm의 작은 꽃 길이로 결정됩니다 (그림 1A). 벼꽃차례가 잎칼집으로 덮여 있는지 확인하십시오. 70% 알코올 면봉으로 각 꽃차례를 닦고 자르기 전에 말리십시오.
   2. 꽃차례를 깨끗하고 멸균 벤치로 가져옵니다. 멸균된 가위로 작은 조각으로(작을수록 좋음) 절단을 NBD2 매체가 들어 있는 페트리 플레이트로 옮깁니다(그림 1B, 표 1).
   3. 굳은살을 유도하기 위해 약 10-14일 동안 26°C의 어두운 곳에서 플레이트를 배양합니다(그림 2A).
      메모: Agrobacterium 침투를 위해 새로 형성된 굳은살을 직접 사용하거나(1.2.7단계) 새로운 NBD2 배지에서 한 번 더 수리하여 더 많은 굳은살을 얻습니다. 8-10일마다 굳은살을 새로운 NBD2 배지로 옮깁니다.
2. 변화와 공동 육성
   1. 형질전환을 위해 바이너리 플라스미드를 포함하는 A. tumefaciens 박테리아를 sgRNA-CAS9 구조체와 함께 사용합니다. 추가 사용을 위해 A. tumefaciens 균주를 -80°C에서 50% 글리세롤과 함께 YEB 배지(표 1)에 보관하십시오.
   2. -80°C 글리세롤 스톡에서 선택적 항생제를 함유한 YEB 한천 배지로 줄무늬 A. tumefaciens(표 1)를 만들고 25-28°C에서 48-72시간 동안 성장하여 콜로니가 나타날 수 있도록 합니다.
   3. 50mL 원추형 멸균 시험관에 YEB 플레이트에서 선택적 항생제를 포함한 동일한 선택적 항생제(표 1)를 함유한 5mL의 액체 YEB 배지로 단일 콜로니를 접종합니다. 박테리아가 OD₆₀₀이 0.5로 성장할 때까지 25-28 °C에서 250 x g의 오비탈 쉐이커로 흔듭니다.
   4. 250mL 코니컬 플라스크에 동일한 선택적 항생제를 투여한 100mL의 YEB 배지(표 1)에 1mL의 박테리아 현탁액을 첨가하고 250 x g, 28°C에서 4시간 동안 오비탈 쉐이커에서 흔듭니다.
   5. 박테리아를 포집하기 위해 실온에서 4,000 x g에서 10분 동안 원심분리기를 사용합니다. 상등액을 버리십시오.
   6. AAM-AS 배지(표 1)로 박테리아 펠릿을 재현탁시키고 현탁액을 OD₆₀₀ = 0.4로 희석합니다.
      메모: 박테리아 현탁액의 완벽한 OD는 효율적인 변형에 매우 중요합니다. 굳은살의 과도한 박테리아 성장을 제거하는 데 도움이 됩니다.
   7. 1.1.3단계에서 약 150개의 건강하게 자라는 연황색 깨지기 쉬운 배아 캘리를 150mL 멸균 플라스크에 수집합니다. 1.2.6 단계의 50–75 mL 박테리아 세포 현탁액을 멸균 플라스크에 첨가한 다음 10–25 mL의 새로운 AAM-AS 배지를 추가하여 캘리를 10-20분 동안 담그고 가끔 흔듭니다.
   8. 플라스크의 박테리아 현탁액을 조심스럽게 붓고 멸균 여과지 #1 또는 티슈 페이퍼를 사용하여 굳은살에서 과도한 박테리아 현탁액을 건조시킵니다. 그런 다음 멸균 여과지 #1로 덮인 NBD-AS 매체(표 1)가 있는 페트리 접시에 놓습니다. 25-28 °C의 어두운 곳에서 3일 동안 배양하고 박테리아 과다 증식을 확인합니다.
3. 저항성 굳은살을 위한 선택
   1. 공동 재배 3일 후, 캘리를 멸균 여과지가 있는 멸균 페트리 접시에 옮깁니다.
   2. 깨끗한 벤치에서 캘리를 2시간 동안 자연 건조합니다. 굳은살이 여과지에 부착되지 않았는지 확인하십시오.
   3. 멸균 핀셋을 사용하여 캘리를 1차 선택 배지 NBD2(40mg/L 하이그로마이신 및 250mg/L 티멘틴 포함)로 균일하게 옮깁니다(표 1). 어둠 속에서 25-28 ° C에서 2 주 동안 문화 칼리.
   4. 2주 후, 칼리를 신선한 선택 배지 NBD2(40mg/L 하이그로마이신 및 250mg/L 티멘틴 포함)가 포함된 새 플레이트에 균일하게 옮깁니다(표 1). 어둠 속에서 25-28 ° C에서 2 주 동안 칼리를 더 배양하십시오.
4. 캘러스 분화
   1. 굳은살을 새로운 MS Medium(25mg/L hygromycin 및 150mg/L timentin 포함)으로 옮깁니다(표 1). 약 2 주 동안 25-28 ° C의 빛 아래에서 배양합니다.
   2. 1.4.1단계를 한 번 더 반복합니다.
   3. 새싹을 새로운 MS 배지(10mg/L 하이그로마이신 포함)로 옮겨 더 많은 싹을 증식시킵니다.

표 1: 쌀 변형을 위한 미디어 구성. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

결과

그림 1 : 굳은살 유도를 위한 출발 물질. (A) 감수 분열 단계에서 어린 쌀 꽃차례. (B) NBD2 배지에서 자라는 어린 꽃차례를 해부했습니다. 막대 = 2cm(A).

그림 2 : Agrobacterium-mediated transformation에 의한 형질전환 세포주를 생산하는 절차. (A) 어린 꽃차례에서 생성된 쌀 칼리. (B) 칼리의 하위 문화. (C) A. tumefaciens를 사용한 calli의 배양. (D) ...