전기천공법 매개 체외 유전자 전달: 배양된 세포에 형광 리포터 단백질 인코딩 플라스미드를 도입하는 전기 펄스 기술

초록

출처: Lo, J. C. W. et al., 과립 세포 전구체에서 1차 섬모 의존성 신호 경로를 연구하기 위한 효율적이고 비용 효율적인 전기천공법.J. Vis. 특급(2021년)

이 동영상은 형광 단백질 인코딩 플라스미드 DNA를 마우스의 1차 소뇌 과립 세포 전구체에 도입하는 전기천공법 기술을 보여줍니다.

프로토콜

1. Hh 수용체 전이유전자 과발현을 위한 전기천공법: pEGFP-Smo

1. 2mm 갭 큐벳을 사용한 전기천공의 경우, 전기천공의 각 반응에 대해 다음과 같은 플라스미드-세포 전기천공법 혼합물을 준비합니다: 1.2 ×^{10 6} 마우스 1차 소뇌 과립 세포 전구체 세포 및 10μg의 pEGFP-mSmo(Tris-EDTA 완충액 또는 멸균 dH₂O에서 DNA 스톡 농도를 ~2-5 μg/μL로 조정) Opti-MEM의 100 μL.
   메모: 세포가 충분하지 않은 경우 총 세포 수를 줄이십시오(이는 electroporation 효율을 감소시킬 수 있음). 그러나 플라스미드의 양이나 큐벳당 사용되는 Opti-MEM의 총 부피를 조정하지 마십시오. 실험에 필요한 총 세포 수가 1.5 × 10⁶ 세포를 초과하는 경우 그에 따라 전기천공법 혼합물을 스케일업하고 여러 전기천공법 반응을 별도로 수행합니다. 큐벳은 최대 5회까지 재사용할 수 있습니다.
2. 코팅된 커버슬립이 포함된 24웰 배양 플레이트의 각 웰에 0.5mL의 배양 배지를 첨가하여 전기천공법 후 세포 시딩 플레이트를 준비하고 CO₂ 인큐베이터에서 37°C로 따뜻하게 유지합니다. 세포 부착을 위해 커버슬립을 준비하려면 100μg/mL의 폴리-D-라이신(PDL, 멸균 dH_2O에서 1mg/mL)이 포함된 고압멸균 12mm 유리 커버슬립을 37°C에서 최소 1시간 동안 배양합니다. 사용할 때까지 4°C의 동일한 PDL 용액에 커버슬립을 보관하십시오.
3. 멸균 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 필요한 수의 세포를 피펫으로 넣고 실온에서 5분 동안 200×g으로 회전합니다. 상등액을 버리고 세포 펠릿을 200μL의 Opti-MEM에 재현탁합니다. Opti-MEM으로 이 단계를 두 번 반복하여 튜브에 잔류 배양 배지가 없는지 확인합니다.
   메모: 24웰 플레이트의 모든 웰/커버슬립에 대해 1.2-1.3 × 10⁶ 셀/웰을 전기화하여 배양 다음 날에 ~70-75% 세포 포화도를 얻습니다.
4. electroporation의 매개 변수를 표 1과 같이 설정하십시오.
5. 전기천공 반응을 부드럽게 피펫팅하여 잘 섞인 후 긴 P200 팁을 사용하여 정확한 부피의 100μL의 혼합물을 2mm 갭 큐벳으로 옮깁니다. 기포가 생기지 않도록 하십시오.
6. 큐벳 챔버에 큐벳을 놓습니다.
7. electroporator의 Ω 버튼(재료 표 참조)을 누르고 ~30-35여야 하는 임피던스 값을 기록해 둡니다. 전기 임피던스 값이 30-35 범위 내에 Ω 않도록 하려면 100μL의 정확한 부피를 준수하십시오.
8. 시작 버튼을 눌러 펄스를 시작합니다.
9. 판독 프레임에 표시된 측정된 전류와 줄의 값을 기록합니다.
10. 큐벳 챔버에서 큐벳을 제거합니다.
11. 즉시 예열된 배양 배지 100μL를 큐벳에 추가하고 2-3회 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 다시 현탁시킵니다. 세포 현탁액을 1.2.
    단계에서 준비한 코팅된 커버슬립이 포함된 24웰 플레이트로 즉시 옮깁니다. 메모: 세포 사멸을 최소화하려면 전기천공법 직후 세포를 파종하십시오.
12. CO₂ 인큐베이터에서 37°C에서 세포를 배양합니다. 세포 분리를 방지하기 위해 3시간 동안 세포를 방해하지 않고 그대로 두십시오.
13. 파종 후 3시간이 지나면 상등액 배지의 절반을 부드럽게 흡인하고 폐기하여 부유 데드 세포와 파편을 제거하고 동일한 양의 예열된 배양 배지로 교체합니다.
14. CO₂ 인큐베이터에서 37 ° C에서 세포를 배양합니다.

개 개 개 개

	포링 펄스 설정		전송 펄스 설정
	마우스 기본 GCP	1차 뉴런	마우스 기본 GCP	1차 뉴런
전압	275 볼트	275 볼트	20 볼트	20 볼트
길이	1 밀리세컨드	0.5 밀리세컨드	50 밀리세컨드	50 밀리세컨드
간	50 밀리세컨드	50 밀리세컨드	50 밀리세컨드	50 밀리세컨드
아니요.	2	2	5	5
D 비율	10%	10%	40%	40%
극성	+	+	±	±

표 1: Super Electroporator NEPA21 TYPE을 사용한 마우스 1차 GCP 및 1차 뉴런의 전기천공 매개변수

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
B27 보충제	생명 기술 주식회사	17504044
글루탐MAXTM-I, 100배	Gibco, 라이프 테크놀로지스	35050061	L-글루타민 대체물
마트리겔	BD 바이오사이언스	354277	기저막 매트릭스
뉴로기저	Gibco, 라이프 테크놀로지스	21103049
Poly-D-lysine 하이드로 브로마이드	시그마 알드리치	P6407
CU 500 큐벳 챔버	네파게네	큐500
EPA 전기천공법 큐벳(2mm 간격)	네파게네	EC-002 (영문
옵티-MEM	생명 기술 주식회사	31985070	transfection을 위한 Reduced-serum 배지
pEGFP-mSmo	애드진	25395
슈퍼 전기포레이터 NEPA21 TYPE II 체외 및 생체 내 전기천공법	네파게네	네파21	전기포레이터

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