기생충 형태의 핵 발굴: 형광 단백질 인코딩 플라스미드를 포자 핵에 전달하는 전기천공법 기반 형질 주입 방법

초록

출처: Duan, C., et al. 닭 Eimeria 기생충의 핵 발굴 및 생체 내 증식. J. Vis. 특급 (2020)

이 비디오에서는 형광 리포터 단백질 인코딩 플라스미드 DNA를 닭 Eimeria 기생충의 포자암 형태로 전달하는 전기천공법 기반 형질 주입 절차인 nucleofection에 대해 설명합니다.

프로토콜

1. merozoites 또는 sporozoites의 nucleofection

1. 기생충의 핵 발굴 전 준비
   1. 하나의 튜브에 약 10⁷ 개의 merozoites 또는 sporozoite를 준비합니다. 메로조이트를 트랜스펙션하는 경우 3-4개의 튜브를 준비합니다.
   2. 10 μg.
      이상의 양의 플라스미드 DNA 또는 정제된 PCR 단편을 준비합니다. 메모: 본 연구에서 사용된 플라스미드는 2개의 유전자를 포함하고 있습니다: 향상된 황색 형광 단백질(EYFP)과 톡소플라즈마 곤디이(TgDHFR-TS)에서 유래한 디하이드로폴레이트 환원효소 티미딜레이트 합성효소.
   3. 25U의 제한 효소를 준비합니다. 플라스미드가 선형화되는 경우, 제한 효소는 transfection 효율을 향상시킬 수 있습니다. 플라스미드가 원형인 경우, 제한 효소를 생략합니다.
   4. 85μL의 핵펙션 완충액을 준비합니다(표 1): 20μL의 핵펙션 완충액 I과 1mL의 핵펙션 완충액 II를 혼합하고 용액의 일부를 사용합니다. 총 버퍼의 부피는 100μL입니다.
2. 핵 절제
   1. sporozoite 또는 merozoite 현탁액을 600 x g에서 10분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상등액을 버리십시오.
   2. 다음 순서로 85μL의 핵 transfection buffer, 10μg의 플라스미드(PCR 절편) 및 25U의 제한 효소(보통 5μL)를 sporozoites 또는 merozoites가 포함된 1.5mL 튜브에 추가합니다.
   3. 현탁액을 nuclear transfection cup으로 옮깁니다. 컵을 핵 전달 홈에 넣습니다.
   4. 전원 버튼을 사용하여 핵 절제 장치를 켜고 형질 주입 절차 U-033을 선택합니다. 핵 절제 장치가 자유 프로그램 선택 모드에서 시작되면 X 버튼을 눌러 이 모드를 종료합니다.
   5. 프로그램이 끝나면 핵 절제 장치의 X 버튼을 누르면 화면에 OK가 표시되어 핵 절제가 성공했음을 나타냅니다.
   6. 0.5-1 mL의 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)을 핵 펙션 컵에 첨가하여 반응을 멈추고 부드럽게 혼합한 후 현탁액을 1.5 mL 튜브로 옮깁니다.

완충기	구성
핵펙션 완충액 I	ATP-디소듐 2g, MgCl2-6H 2O 1.2g, 물 10ml
핵펙션 완충액 II	KH2PO4 6 g, NaHCO3 0.6 g, 포도당 0.2 g, 물 500 ml
*물:증류수

표 1: 버퍼의 구성.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM을 참조하십시오.	맥진	CM15019
핵 절제 장치	론자/아막사	90900012 (Nucleofector II)
포도당	시그마	V900116번
ATP-디소듐	시그마	A26209
셀룰로오스 DE-52	솔라바이오	C8350
KH2사서함4	시그마	번호 V900041
저속 원심분리기	베이징 시대 BEILI 분리기 CO., LTD.	DT5-2
재질 보기 MgCl2	시그마	449164
나HCO3	시그마	144-55-8
PBS (PBS)	솔라바이오	P1010
Sorvall Legend Micro 17 마이크로 원심분리기	써모피셔 사이언티픽	75002430
트립신	솔라바이오	T8150
Percoll(DG 그래디언트 스톡 솔루션)	GE 헬스케어	Tel.: 17-0891-09