렌티바이러스 벡터 기반 페리비텔린 주입: 관심 유전자를 수정된 단세포 마우스 난모세포로 transduction하는 방법

초록

출처: Dussaud, S. et al., 유전자 변형 마우스의 렌티바이러스 매개 생산: 설립자의 직접 연구를 위한 간단하고 매우 효율적인 방법. J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오는 수정된 마우스 배아의 주위 공간에 렌티바이러스 벡터를 전핵 주입하는 방법을 설명합니다. 렌티바이러스는 변형유전자를 포함하고 있으며, 이 유전자는 수정된 배아의 게놈에 통합되어 결국 형질전환 마우스를 생성한다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 수정란에서 적운 세포를 제거합니다.

1. 실체현미경으로 2개의 인슐린 주사기를 사용합니다: 첫 번째 주사기는 난관을 잡기 위한 것이고, 두 번째 주사기는 앰플라를 찢어내고 수정란을 히알루로니다아제 작용액에 분산시키기 위한 것입니다.
2. 계란을 모으기 위해 준비된 유리 피펫을 튜브와 마우스피스에 장착된 0.22μm 필터에 연결하여 모든 계란을 흡인합니다. 모든 난자를 모아 100μL의 M2 배지 6방울에 연속적으로 통과시켜 세척합니다.
3. 씻은 수정란을 M37 배지에서 5% CO₂ 분위기의 가습된 16°C 인큐베이터에 넣습니다.

2. 주입 피펫 만들기

1. 외경이 10mm인 얇은 벽의 유리 모세관 튜브(길이 15-15cm)를 사용하고 이 모세관을 수평 마이크로피펫 풀러에 고정합니다.
   메모: 대부분의 수평 피펫 풀러에서는 3가지 매개변수를 조정할 수 있습니다: 열력, 인장 강도 및 가열과 인장 사이의 시간 지연. 이러한 파라미터를 조정하여 그림 1A에 제시된 것과 유사한 주입 피펫을 얻습니다. 일상적으로 DNA 미세주입을 수행하는 사용자의 경우 표준 설정을 사용하고 가열과 당기기 사이의 지연을 조정하여 피펫 팁의 전체 모양을 변경하십시오.

3. 홀딩 파이펫 만들기

1. 주입 피펫을 사용하여 고정 피펫을 준비합니다.
2. 주입 피펫을 마이크로포지에 부착합니다. 마이크로포지로 피펫을 절단하여 80 - 100 μm 직경의 날카로운 대칭 팁을 얻습니다. 그런 다음 마이크로 포지에서 열로 팁을 연마하여 날카로운 울타리가없는 대칭 원형 모양을 얻습니다.

4. 렌티바이러스 벡터를 함유한 주입 피펫 제조

1. 160 x g에서 2분 동안 렌티바이러스 벡터 현탁액을 원심분리하여 얼어붙은 렌티바이러스 스톡에 자주 존재하는 펠릿 파편으로 이동합니다.
2. 상층액을 회수하여 클래스 II 안전 캐비닛의 새 0.5mL 튜브로 옮깁니다.
3. 1μL의 상층액을 Micro-loader를 사용하여 5단계에서 설명한 대로 준비된 주입 피펫으로 옮깁니다.
4. 올바른 micromanipulator의 기기 홀더에 주입 피펫을 설정합니다. 홀딩 피펫을 왼쪽 micromanipulator.
   에 연결합니다. 메모: 렌티바이러스 벡터의 transduction titter는 founder production의 효능과 직접적인 상관관계가 있습니다. 높은 효능(>70%)을 위해 100ng의 p24 capsid protein/μL 범위의 역가를 가진 바이러스 벡터를 사용하십시오. 역가가 형질 도입 단위(TU)로 표시되는 경우 역가는 10⁹ TU/mL 이상이어야 합니다. 렌티바이러스 벡터 스톡은 보충 방법에 설명된 대로 수포성 구내염 바이러스(VSV) 당단백질-G를 인코딩하는 p8.91 캡슐화 플라스미드(pHCMV-G)와 함께 293T 세포의 일시적 형질주입에 의해 생성되어야 합니다.

5. 마이크로 주입

1. 함몰 슬라이드의 중앙에 8μL의 M2 배지를 분배하고 증발을 방지하기 위해 가벼운 파라핀 오일(배아 테스트)로 덮습니다.
2. 달걀 20개를 가능한 한 흩어지지 않게 떨어뜨립니다.
   주의: 배아를 낳을 때 거품을 만들지 마십시오.
3. 주입 피펫의 끝이 열려 있는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 고정 피펫으로 주입 피펫을 두드립니다.
4. 마이크로인젝터의 주입 시간을 20초
   로 설정합니다. 메모: 바이러스 현탁액의 점도는 perivitelline 공간에서 바이러스 벡터의 분산을 명확하게 시각화할 수 있습니다. 사출 압력은 사출 후 20초 이내에 전체 공간을 채우도록 조정해야 하며, 이는 10-100pL의 부피를 나타냅니다. 사출 압력은 600hPa를 초과해서는 안 됩니다.
5. 2개의 전핵체와 2개의 극체를 포함하는 수정란 1개를 실체현미경 아래의 고정 피펫으로 흡인합니다.
6. 마이크로인젝터로 난자를 perivitelline space에 주입합니다.
   주의: 주입 피펫으로 원형질막을 만지지 마십시오.
7. 20개의 난자 배치로 사용 가능한 모든 수정란을 주입하고 주입된 난자를 예열된 M16 배지에 즉시 5% CO₂.
   의 분위기로 가습된 37°C 인큐베이터에 넣습니다. 메모: 주입된 난자를 주입 후 배아 이식 전에 최소 30분 동안 배양합니다.

결과

그림 1: 미세주입 피펫 준비 및 유전형 분석.
(가) DNA 또는 렌티바이러스 벡터 주입에 사용되는 피펫 간의 주요 차이점을 강조하기 위한 microinjection 파이펫의 개략도.왼쪽 패널: 두 파이펫 유형의 전체 모양이 그려져 있습니다. 점선 원은 피펫 팁의 확대된 영역을 강조 표시합니다. 피펫 팁의 사진도 제공됩니다. 렌티바이러스 주사의 경우 점선과 해당 그림으로 표시된 대로 팁을 부러뜨려야 합니다. 오른쪽 패널: 난자 주입 설정의 예: 왼쪽에 홀딩 피펫이 있고 수정란과 주입 피펫이 하나의 전핵 또는 주위 공간에 있습니다. 스케일 바 = 50 μm. (B) 8개의 서로...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
인슐린 주사기	폭스바겐	전화: 613-3867	테루모 마이젝터
교정된 미세모세관 피펫을 위한 흡인기 튜브 어셈블리	시그마	A5177-5개
히알루로니다아제 효소 30mg	시그마	H4272	생쥐 배아 테스트 완료
붕규산 유리 모세관	하버드 기구	GC 100-10
도립 현미경	니콘	트랜스퍼맨 NK2 5188	Hoffman 모듈레이션 콘트라스트 조명이 필요합니다.
마이크로 매니퓰레이터	에펜도르프	셀트램 에어