Laser-Assisted Lentiviral Gene Delivery: Lentiviral 유전자 전달을 촉진하기 위해 마우스 수정란을 투과하는 기술

초록

출처: Martin, N. P., et al. 마우스 수정란에 레이저 보조 렌티바이러스 유전자 전달. J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오에서는 렌티바이러스 유전자 전달을 촉진하기 위해 마우스 수정란에서 투명대(zona pellucida)의 보호층을 레이저로 투과하는 방법을 보여줍니다. 렌티바이러스는 관심 유전자가 게놈에 안정적으로 통합된 형질전환 동물을 생성할 수 있도록 합니다.

프로토콜

1. XYClone 레이저를 사용한 마우스 수정란의 천공

1. 제조업체의 권장 사항에 따라 XYClone 레이저를 설정하고 보정합니다. 일반적으로 체외 수정에 사용되는 다른 레이저는 XYClone 레이저를 대체하여 수정란을 천공할 수 있습니다.
   1. 레이저 컨트롤러 박스 와이어를 현미경의 레이저 장치에 연결합니다.
   2. USB 포트를 통해 레이저 소프트웨어를 실행하는 컴퓨터에 레이저 컨트롤러 상자를 부착합니다. 3.1.3. 레이저 컨트롤러를 연결하고 전원을 켭니다.
   3. 접안렌즈를 통해 테스트 샘플(예: 유리 슬라이드의 드라이 지우기 표시)을 천공합니다.
   4. 작은 스크류 드라이버(레이저 키트에 포함)를 사용하여 현미경 접안렌즈를 통해 보이는 LED 광과 일치하도록 레이저의 X 및 Y 위치를 조정하고 레이저를 보정합니다.
2. 마우스 수정란이 들어 있는 KSOM 드롭플레이트를 현미경 스테이지에 놓습니다. 플레이트를 인큐베이터 외부에 15분 이상 보관하지 마십시오.
3. 현미경 접안렌즈를 통해 배아의 투명대에 초점이 맞춰져 있고 레이저 LED 광이 보이는지 확인합니다.
4. 현미경 이동tage LED 조명/레이저로 구역을 대상으로 합니다.
5. 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 XYClone 레이저를 250μs로 설정합니다.
6. LED 조명 크기를 원하는 치수로 조정합니다(이 실험에서는 설정 5).
7. 레이저로 각 수정란의 구역을 세 번 뚫습니다. 구역은 뚫거나 얇게 할 수 있습니다. 위의 설정을 사용하여 레이저는 직경이 10μm인 구멍을 생성합니다(그림 1).
   메모: 극체 가까이를 조준하면 레이저가 배아 세포에서 멀어지게 됩니다.
8. 다음 단계로 이동하기 전에 조직 배양 인큐베이터에서 수정란이 2시간 동안 회복되도록 합니다.

2. XYClone 레이저 천공 후 마우스 수정란의 형질 주입

1. 농축된 렌티바이러스 2μL(1e8 TU/mL 역가 이상)를 50 μL KSOM 드롭에 피펫. 위아래로 피펫을 피펫하지 마십시오. 수정란은 피펫 끝에 쉽게 부착됩니다. 당사의 경험에 비추어 볼 때, 3 μL 미만의 부피에서 렌티바이러스의 1e5-5e5 형질주입 단위가 유전자 전달에 최적입니다.
2. 수정란이 배후포로 자라도록 4일 동안 인큐베이터에서 기다립니다. 미디어를 변경할 필요가 없습니다.

3. 형질도입된 마우스 배아를 유사 임신 마우스로 비수술적 이식

1. 짝짓기 후 3.5일 후에 pseudopregnant 마우스를 사용하십시오.
2. NSET(Non-Surgical Embryo Transfer) 장치를 사용하여 유사 임신 마우스에 마우스 배아를 이식합니다.
   1. 수술용 또는 해부 현미경을 사용하여 질 검경을 삽입하여 자궁경부를 시각화합니다.
   2. NSET(Non-Surgical Embryo Transfer) 장치를 자궁경부에 약 5mm 삽입하고 약 2μL.
      의 부피로 배아를 증착합니다. 메모: 멸균 NSET 장치는 각 이송에 사용되며 시술 후 폐기됩니다. 배아 조작에 사용되는 모든 시약은 멸균 상태여야 합니다.
3. 2μL 부피의 KSOM에 10-15개의 건강한 배반포를 각 가임신 마우스로 옮깁니다.
4. NSET가 성공적이었는지 여부를 결정하기 위해 다음 며칠 동안 가임신 마우스의 체중 증가를 계속 모니터링하고 측정합니다.
5. 임신한 쥐가 자연적으로 출산할 수 있도록 하거나 배아 이식 후 17일 후에 제왕 절개를 수행하여 새끼를 회복합니다. 제왕절개는 배아가 매우 적고 자연 분만을 하기에는 너무 커지는 경우 종종 필요합니다.
6. 유전자 분석을 위해 새끼에서 조직을 수집하여 형질 전환 속도를 결정합니다.

결과

그림 1 : 마우스 수정란의 레이저 처리. 구멍을 만들기 위해 zona를 뚫는 것과 zona를 얇게 만드는 예.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
CD510B-1 플라스미드	시스템 생명과학	CD510B-1	EF1a-copGFP를 발현하는 렌티바이러스를 패키징하는 데 사용됩니다.
디메틸폴리실록산	시그마	DMPS5X	배아 배양
XYClone 레이저	Hamilton Thorne 생명과학		생쥐 수정란을 뚫는
비수술적 배아 이식(NSET) 장치	파라텍	60010	배아의 NSET
KSOM 배지	밀리포어	MR-020P-5F	배아 배양
KSOM의 구성:			mg/100mL
염화나트륨			555
케이클			18.5
KH2PO4			4.75
마그네슘SO4 7H2O			4.95
염화칼슘2 2H2O			25
나HCO3			210
포도당			3.6
Na-피루브산			2.2
DL-젖산, 나트륨 염			0.174mL
10mM 에다			100μL
스트렙토마이신			5
페니실린			6.3
0.5% 페놀 레드			0.1mL
L-글루타민			14.6
MEM 필수 아미노산			1mL
MEM 비필수 AA			0.5mL
증권 시세			100

시리즈 것 년 의 조 대 분 분 의 개 표시기 개