Biolistic-Mediated Gene Transfer: Biolistic Gene Gun을 통해 표적 세포에 관심 유전자를 전달하는 기술

초록

출처: Taylor, T., et al. 기회주의적 곰팡이 병원균 Cryptococcus neoformans로 형광 태그 유전자의 생물학적 변환. J. Vis. 특급 (2015).

이 비디오에서는 배양된 세포에서 생물학적 유전자 총 매개 유전자 전달 프로토콜을 보여줍니다. 이 방법은 최소한의 DNA를 사용하여 안정적인 유전자 변형을 할 수 있는 간단한 방법을 제공합니다.

프로토콜

1. DNA 준비

1. 집게를 사용하여 주황색 매크로캐리어 생물학적 디스크를 100% 에탄올에 담가 준비합니다. 드라이어라이트가 들어 있는 큰 페트리 접시에 디스크를 넣어 건조시킵니다(드라이어라이트가 디스크에 닿지 않도록 주의).
2. 건조되면 매크로캐리어 디스크를 은색 디스크 홀더(이전에는 100% 에탄올로 닦음)에 밀어 넣습니다.
3. 100% 에탄올에 현탁된 Vortex gold 마이크로캐리어 비드와 12μl의 분취액을 1.5ml 마이크로원심분리기 튜브에 넣고, 형질전환당 하나의 튜브를 만듭니다.
4. 각 튜브에 DNA 2μg(바람직하게는 DNA 1μg/μl 2μl), 2μl 2.5M CaCl₂ 및 2μl 1M 스페르미딘 프리 염기 순으로 추가합니다.
5. 1.4단계에서와 같이 DNA가 없는 음성 대조군을 설정합니다.
6. 각 튜브를 소용돌이치고 주변 온도에서 5분 동안 배양합니다. 이 배양 중에 침전된 구슬을 다시 현탁시키기 위해 때때로 각 튜브를 부드럽게 튕깁니다.
7. 225 x g에서 30초 동안 튜브를 돌려 DNA로 코팅된 금 구슬을 펠릿화합니다. 상층액을 조심스럽게 제거하고(피펫팅 또는 흡인으로) 폐기합니다.
8. 600μl의 100% 에탄올에 천천히 위아래로 피펫팅하여 비드를 완전히 재현탁합니다.
9. 225 x g에서 30초 동안 튜브를 돌려 패킹하지 않고 비드를 펠릿화합니다. 상층액을 조심스럽게 제거하고 버리십시오.
10. DNA로 코팅된 골드 비드를 8μl의 100% 에탄올에 천천히 위아래로 피펫팅하여 재현탁합니다.
11. DNA로 코팅된 금 구슬을 직경 1cm의 생물학적 디스크 중앙에 피펫으로 넣고 건조시킵니다.
    메모: 생물학적 원반의 중앙에 보이는 말린 금색 원은 금 구슬이 충분히 농도되어 있음을 나타냅니다.
    메모: DNA로 코팅된 골드 비드가 장전된 매크로캐리어 디스크는 이제 유전자 총과 함께 사용할 준비가 되었습니다.

2. 진건 조작

1. 진공 펌프를 켭니다.
2. 압력 게이지에서 약 2,200psi의 압력에 도달할 때까지 손잡이를 시계 반대 방향으로 돌려 헬륨 가스를 켭니다.
3. 왼쪽의 빨간 스위치를 뒤집어 유전자 총을 켭니다.
4. 진공 청소기와 통풍구의 유속이 조정되어 진공 청소기가 15초 이내에 28인치 Hg에 도달하도록 하십시오.
5. Rupture Disc와 매크로캐리어 사이의 거리가 약 3/8인치인지 확인하십시오.
6. 에탄올로 닦아 챔버 전체를 청소하십시오.
7. 파열 디스크를 100% 에탄올에 담그십시오. 멸균 표면(예: 페트리 접시)에서 건조시킵니다.
8. 토크 렌치를 사용하여 파열 디스크 홀더를 풉니다. 깨끗한 파열 디스크를 홀더에 삽입합니다. 파열 디스크 홀더를 제자리에 다시 나사로 고정하고 토크 렌치로 오른쪽으로 한 번 돌려 조입니다.
   메모: Rupture Disc는 각 촬영 후에 교체됩니다.
9. 메쉬 스크린을 100% 에탄올에 담그십시오. 멸균 표면(예: 페트리 접시)에서 건조시킵니다.
10. 건조되면 세척된 메쉬 스크린을 흰색 플라스틱 장착 플레이트에 놓습니다. 매크로캐리어 디스크 홀더 DNA의 면이 아래로 향하게 하여 디스크 챔버에 넣습니다. 은색 캡을 조이고 장착 플레이트를 가장 높은 슬롯에 놓습니다.
    메모: 메쉬 스크린은 각 촬영 후에 교체됩니다.
11. 바닥 플레이트에 1M 소르비톨이 포함된 YPD 한천 플레이트를 놓습니다.
12. 챔버 도어를 닫고 제자리에 잠급니다.
13. 중간 빨간색 스위치를 위로 길게 눌러 진공을 작동시키고 진공이 28인치 Hg에 도달하도록 합니다. 적절한 진공 수준에 도달하면 이 스위치를 아래쪽 위치로 이동합니다. 준비가 되면 오른쪽에 있는 빨간색 스위치를 길게 눌러 발사합니다. 파열 디스크가 터지면 즉시 발사 버튼에서 손을 떼고 중간 빨간색 스위치를 중간 위치로 눌러 챔버를 0psi로 환기시킵니다.
14. 파열 디스크 파편을 청소하고 유전자 총을 끕니다. 그런 다음 손잡이를 시계 방향으로 돌려 헬륨 가스를 끄고 마지막으로 진공 펌프를 끕니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.6 μm 골드 비즈	바이오 라드	165-2262	http://www.bio-rad.com
스페르마딘 프리 베이스	시그마- 알드리치	S0266	https://www.sigmaaldrich.com
1350psi 파열 디스크	바이오 라드	165-2330	http://www.bio-rad.com
화면 중지	바이오 라드	Tel.: 165-2336	http://www.bio-rad.com
대형 캐리어 디스크	바이오 라드	165-2335	http://www.bio-rad.com
PDS-1000/He 시스템	바이오 라드	Tel.: 165-2257	http://www.bio-rad.com
마이크로퓨지 18 원심분리기	벡크만 쿨터	F241.5P	www.beckmancoulter.com

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