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1. 폴리 오르니틴 / 라미닌 (Po / L) 접시 코팅
참고: 볼륨은 24웰 플레이트를 코팅하도록 조정됩니다.
- 필요한 경우 멸균 12mm 커버슬립을 웰에 넣습니다.
- 물에 용해된 500μL의 10μg/mL 폴리-L-오르니틴 용액으로 웰을 코팅합니다.
- 우물을 실온에서 1시간 동안 가라앉히십시오.
- Poly-L-Ornithine 용액을 제거하고 30분 동안 자연 건조합니다.
- 37°C에서 하룻밤 동안 중탄산염 L-15.
에 500μL의 3μg/mL 라미닌으로 웰을 코팅합니다.
메모: 웰은 인큐베이터에서 37 ° C에서 7 일 동안 보관할 수 있습니다. 긴 배양의 경우 웰 사이에 멸균 PBS를 추가하면 매체 증발을 방지하는 데 도움이 될 수 있습니다.
2. 운동 뉴런 문화
- MN을 24웰 플레이트에서 웰당 500μL의 배양 배지에 있는 적절한 밀도(보통 5,000-10,000개)로 희석합니다<>
메모: 파종 밀도는 6웰 플레이트와 96웰 플레이트에 대해 각각 약 30,000개 및 1,500개 세포입니다.
- P1000으로 라미닌 용액을 제거합니다.
- 건조를 피하기 위해 배양 배지에 희석된 MN을 즉시 코팅 플레이트로 옮깁니다.
- 37 ° C에서 2 일 동안 배양하십시오.
3. 운동 뉴런의 자기 발굴
참고: 다음 단계에서 사용되는 양은 24웰 플레이트의 한 웰을 transfection하기 위한 것입니다. 다른 형식에 대해서는 제조업체의 프로토콜을 참조하십시오.
- DNA 준비를 위해 50μL의 신경 세포 배양 배지에 DNA 1μg을 재현탁하고 5초 동안 와류를 사용합니다. 여기에서는 신경필라멘트 cDNA를 제어하는 CAGGS promotor(pCAGEN)가 있는 9kb 플라스미드가 사용됩니다.
- 비드 튜브 준비의 경우 50μL의 뉴런 배양 배지에 1.5μL의 비드를 재현탁합니다.
- 50 μL DNA 용액에 50 μL 비드 용액을 추가하고 실온에서 20분 동안 배양합니다(총 부피 = 100 μL).
- 이 배양 중에 transfection할 웰에서 100μL의 배양 배지를 회수합니다.
알림: 인큐베이터에 마그네틱플레이트를 넣어 37°C로 예열합니다.
- DNA/비드 혼합물 100 μL를 웰로 옮기고 37 °C의 마그네틱 플레이트에서 20-30분 동안 플레이트를 배양합니다.