레트로바이러스 매개 유전자 전달(Retroviral Mediated Gene Transduction): 조작된 레트로바이러스 벡터를 사용하여 배양된 세포에 전이유전자를 전달하는 유전자 전달 기법

초록

출처: Jacquier, A. et al. Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons. J. Vis. 특급 (2019)

이 비디오에서는 1차 신경 세포 배양에서 플라스미드 DNA의 자기 유도 transfection을 보여줍니다. 자기진단(Magnetofection)은 외부 자기장을 사용하여 자성 나노입자에 결합된 플라스미드가 세포 세포질로 전달되도록 유도합니다.

프로토콜

1. 레트로바이러스 구조체 준비

1. 2A 링커로 분리된 T-세포 수용체(TCR) 알파 및 베타 사슬을 MSCV 기반 레트로바이러스 벡터(예: pMIAII 또는 pMIGII)로 서브클론화합니다.
   메모: 2A 링커는 단일 개방형 판독 프레임에서 알파 및 베타 TCR 체인의 화학량론적 및 일치 표현을 허용합니다. 이 벡터에는 형질도입된 세포와 형질도입 효율을 추적하는 데 사용되는 IRES 형광 단백질 카세트(아메트린 또는 GFP)가 포함됩니다.
2. 상업적으로 입수된 plasma prep kit 또는 유사한 제품을 사용하여 Plasmid DNA를 분리합니다. 1-2 μg ^μl-1의 작업 농도를 사용하십시오.

2. 레트로바이러스 생산자 세포주 생성

1. 2단계 공정을 활용하여 레트로바이러스 생산자 세포주를 생산합니다.
   1. 3개의 플라스미드(pVSVG, pEQ-Pam3(-E) 및 관심 벡터)를 가진 293T 세포의 일시적 transfection을 통해 레트로바이러스를 생성하고 293T 세포에서 레트로바이러스 상등액을 취하여 GP+E86 에코트로바이러스 레트로바이러스 생산자 세포주를 transduction합니다.
   2. FACS로 형광 발현 GP+E86 생산자 세포의 상위 40%를 분리하고 형질도입된 GP+E86 생산자 세포를 바이러스의 근원으로 증식합니다.
      메모: high-titer 생산자의 생성은 골수 세포의 효율적인 transduction에 매우 중요합니다.

3. 레트로바이러스 매개 줄기세포 유전자 이식 (-5일차)

1. 이 프로토콜의 Day 0까지 두 개의 confluent 150-mm plate가 충분히 성장할 수 있도록 완전한 DMEM 10%(vol/vol) FBS에서 각 GP+E86 생산자 세포주 0.5 -1.0 x 10⁶을 해동 및 배양합니다.
   메모: 10cm 플레이트에서 각 GP+E86 생산자 세포주를 0.5 - 1.0 x 10⁶개씩 해동하면 5일차에 30 - 50%의 포화도를 얻을 수 있습니다. 또한 0일까지 GP+E86 생산자 세포주를 두 개의 confluent 150-mm 플레이트로 확장하기 위해 5일의 배양을 허용합니다.
   1. 마이코플라스마 오염을 방지하기 위해 5% 태아 송아지 혈청 및 시프로플록사신(10μg/ml)을 포함하는 완전한 조직 배양 배지에서 레트로바이러스 생산자 세포주를 배양합니다.
      메모: 골수 형질도입을 위한 바이러스 상등액을 생성할 때 시프로플록사신의 사용을 중단합니다. 생산자 세포주가 과도하게 증식하면 골수 형질 도입 효율에 부정적인 영향을 미칠 수 있으므로 피하십시오.

4. 레트로바이러스 생산자 세포 배양(0일차)

1. 플레이트 3 x 10 18ml complete DMEM 20%(vol/vol) FBS의 150mm 플레이트당⁶개의 레트로바이러스 생산자 세포.
2. 레트로바이러스 생산자 세포를 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 1,500만 개의 골수 세포(약 2-3개의 기증자 마우스)를 위한 하나의 150mm 플레이트를 예상합니다.

5. 레트로바이러스 상등액(1일차)

1. 다음 날(약 24시간 후), 0.45μm 주사기 필터를 사용하여 10ml 주사기 및 필터로 150mm 플레이트에서 레트로바이러스 상등액을 직접 추출하여 생산자 플레이트(4단계에서 설정)에서 레트로바이러스 상등액을 수확합니다.
2. 제거한 레트로바이러스 상등액을 18ml의 새로운 완전 DMEM 20%(부피/부피) FBS로 조심스럽게 교체합니다.
3. 여과된 레트로바이러스 상등액에 IL-3(20g ^ml-1), IL-6(50g ^ml-1), MSCF(50g ^ml-1) 및 헥사디메트린 브로마이드(폴리브렌)(6μg ^ml-1)를 보충합니다.
   메모: 헥사디메트린 브로마이드는 레트로바이러스 형질도입의 효능이 떨어지지 않도록 2개월마다 신선하게 만들어야 합니다.

6. 레트로바이러스 상등액 및 형질도입(2일차)

1. 24시간 후, 바이러스 생산자 세포주에서 새로운 바이러스 상등액을 수집합니다. 10ml 주사기와 0.45μm 주사기 필터를 사용하여 레트로바이러스 상등액을 여과합니다. 여과된 레트로바이러스 상등액에 IL-3(20g ^ml-1), IL-6(50g ^ml-1) 및 SCF(50g ^ml-1) 및 헥사디메트린 브로마이드(6g ^ml-1)를 보충합니다.
2. 다음으로, 골수 세포가 들어 있는 6웰 플레이트의 각 웰에서 피펫으로 조심스럽게 제거하거나 상단 2ml의 배지를 흡인합니다.
   메모: 일반적으로 우물 중앙에 집중되어 있는 골수를 흡인하지 않도록 조심스럽게 작업하십시오. 또는 제거된 상층액을 회전시켜 손실된 골수 세포를 회수할 수 있습니다.
3. 골수 6웰 플레이트의 각 웰에 사이토카인과 헥사디메트린 브로마이드를 함유한 신선한 바이러스 상등액 3ml를 추가합니다. 플레이트를 비닐로 감싸고 1,000 x g에서 37°C에서 60분 동안 스핀 전달을 반복합니다. 플레이트의 포장을 풀고 37°C 및 5% CO₂에서 하룻밤(약 24시간) 동안 세포를 배양합니다.

7. Fresh Supplemented DMEM 추가 (3일차)

1. 24시간 후, 6.2단계와 같이 골수 세포가 포함된 6웰 플레이트의 각 웰에서 상단 2ml의 배지를 제거합니다. 제거한 배지를 IL-3(20g ^ml-1), IL-6(50g m^l-1) 및 SCF(50g ^ml-1)의 최종 농도가 보충된 새로운 DMEM 20%(vol/vol) FBS로 교체합니다.
2. 골수 플레이트를 37°C CO₂ 인큐베이터에서 24시간 더 배양합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM, 고포도당 + 글루타민	코닝 Cellgro	10-013-이력서	Dulbecco의 Eagle's Medium 변형은 4.5 g/L 포도당, L-글루타민 & 피루브산 나트륨이 함유되어 있습니다
FBS(증권 시세	애틀랜타 생물학	S11550
트립신-베르센	론자	17-161층
0.45μm 실린지 필터	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	제194-2545
폴리브레네	시그마	H9268-10지	dH2O에서 여과되는 메마른
시프로플록사신	폭스바겐	AAJ61970-06
나트륨 피루브산	코닝 Cellgro	25-000-CI
MEM 비필수 아미노산	코닝 Cellgro	25-025-CI
HEPES 1M 솔루션	코닝 Cellgro	25-060-CI
L-글루타민	코닝 Cellgro	25-005-CI
150mm 조직 배양 접시	그라이너 바이오 원	639160
Tisue 배양 처리된 6웰 평판	그라이너 바이오 원	657160
70μm 나일론 셀 스트레이너	송골매	352350
마우스 IL-3	인비트로젠	PMC0033
인간 IL-6	인비트로젠	PHC0063
마우스 줄기 세포 인자	인비트로젠	PMC2113L
PBS 10배	코닝 Cellgro	46-D13-CM
HANKS 버퍼	코닝 Cellgro	21020147
BD 10ml 주사기	BD (영어)	300912
BD 1 ml 주사기	BD (영어)	309659
27 G x 1/2 BD 정밀 글라이드 니들	BD (영어)	305109
30 g x 1/2 BD 정밀 글라이드 바늘	BD (영어)	305106

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