Oil Red O Staining: In Vitro에서 간 지방증을 검출하기 위한 간세포의 중성 지질을 염색하는 기술

초록

출처: Campos-Espinosa, A. et al., A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium. J. Vis. 특급 (2021)

이 비디오에서는 간세포에서 중성 지질의 체외 염색을 통해 간 지방증 또는 간에서의 과도한 지방 축적을 감지하는 방법을 시연합니다. 과도한 지방은 지질 방울 형태로 세포에 축적됩니다. Oil Red O는 이러한 지질 방울에서 세포 내 중성 지질에 결합하는 지용성 염료입니다. 광학 현미경으로 관찰하면 이러한 세포 내 지질 방울이 강렬한 붉은색으로 나타납니다.

프로토콜

1. Oil-Red O를 사용한 지질 염색

1. 24웰 플레이트의 모든 웰에 세포 배양 커버슬립을 넣습니다.
2. 웰당 100,000개의 HepG2 세포를 파딩합니다. 표준 RPMI 1640 1mL를 추가합니다.
3. 37°C 및 5% CO2에서 24시간 동안 사전 배양합니다.
4. 스테아생성 매체에 대한 표준 RPMI 1640 매체를 변경합니다.
5. 24 시간, 2 일, 3 일, 4 일 동안 배양하고 24 시간마다 계단식 배지를 새로 고칩니다.
6. 적절한 시간이 지나면 상등액을 버리십시오.
7. 1mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척합니다. 상등액을 버리십시오.
8. PBS에 4% 파라포름알데히드 1mL로 고정합니다.
9. 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
10. 과도한 파라포름알데히드는 버리십시오.
11. 증류수 1mL로 세포를 헹굽니다.
12. 70% 이소프로판올 1mL를 넣고 5분 동안 배양합니다.
13. 과도한 이소프로판올을 버리십시오. 이 시점에서는 PBS 세척이 필요하지 않습니다.
14. Oil-red O 용액 1mL를 넣고 30분 동안 배양합니다.
15. 과량의 Oil-red O 용액을 버리십시오.
16. 증류수 1mL로 헹굽니다.
17. 헤마톡실린 용액 500μL를 첨가합니다. 3분 동안 배양합니다.
18. 과량의 헤마톡실린 용액을 버리십시오.
19. 증류수 1mL로 헹굽니다.
20. 400x(Objective 40x, Ocular 10x)의 배율로 현미경으로 관찰합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
배양 매체 RPMI 1640	ThermoFisher-Gibco, 미국	제31800-022	-
소 태아 세럼(FBS)	ThermoFisher-Gibco, 미국	A4766801	-
HepG2 세포주	ATCC, 미국	HB-8065	간세포 암종 인간 세포.
가습 인큐베이터	Thermo Electronic Corporation, 미국	모델: 3110	온도(37°C ± 1°C), 습도(90% ± 5%), CO2(5% ± 1%)
도립 현미경 Eclipse	니콘, 일본	모델: TE2000-S	-
이소프로파놀	Sigma-Aldrich, 미국	I9030-4L	-
오일 레드 O 키트	Abcam, 미국	AB150678	중성 지방의 조직학적 시각화를 위한 키트.
파라포름알데히드	Sigma-Aldrich, 미국	P6148-500G	-
페니실린/스트렙토마이신	ThermoFisher-Gibco, 미국	15140-122	항생제 10,000 U/mL 페니실린, 10,000 μg/mL 스트렙토마이신
인산염 완충 식염수	ThermoFisher-Gibco, 미국	제10010-023	-
혈청학적 피펫	Sarstedt, 호주	86.1253.001	비발열성, 멸균, 5mL
혈청학적 피펫	Sarstedt, 호주	86.1254.001	비발열성, 멸균, 10 mL
중탄산나트륨	Sigma-Aldrich, 미국	S5761-1KG	배양 배지의 제조
올레산나트륨	산타크루즈 생명공학, 미국	사우스 캐롤라이나-215879A	-
팔미틴산 나트륨	산타크루즈 생명공학, 미국	사우스캐롤라이나-215881	-
트립신 0.05% /EDTA 0.53 mM	코닝, 미국	25-052-CL	-
24웰 세포 배양 클러스터	코닝, 미국	3524	뚜껑이 있는 평평한 바닥. 조직 배양 처리. 비발열성, 폴리스티렌, 멸균성. 1/팩.

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