Nile Red Staining: 조류에서 세포 내 중성 지질을 검출하고 정량화하는 기술

초록

출처: Storms, Z. J. et al. 형광을 사용하여 조류 세포의 중성 지질을 측정하기 위한 간단하고 빠른 프로토콜입니다. J. Vis. 특급 (2014년)

이 동영상은 조류 세포의 중성 지질을 나일강 염료로 염색하여 검출하고 정량화하는 프로토콜을 보여줍니다.

프로토콜

1. 나일 레드를 사용한 중성 지질의 형광 정량화

참고: 형광 판독에는 5g/L에서 10μl의 조류 현탁액만 필요합니다. 일반적으로 1.5ml의 배양 배지에서 건조 조류 바이오매스를 분리하는 것으로 충분합니다. 또한 분광 광도계에서 램프의 광도는 시간이 지남에 따라 저하될 수 있습니다. 기기의 변동으로 인해 측정에 불필요한 오류가 추가되지 않도록 모든 실험에 표준물질을 포함하는 것이 좋습니다.

1. 알코올 시약 등급 에탄올에 용해된 10μg/ml 농도의 나일 레드 용액을 준비합니다. 이 용액을 4°C의 어두운 곳에 보관하십시오.
2. 탈이온수에 30%(v/v) 에탄올 용액을 준비하고 4°C에서 보관합니다.
3. 모든 조류 샘플을 측정에 사용된 표준물질과 동일한 바이오매스 농도(5g/L 권장)와 동일한 방식으로 준비합니다. 사전 건조된 샘플을 적절한 양의 인산염 완충액(0.6g/L 인산칼륨 이염기성, 1.4g/L 인산칼륨 일염기성)에 현탁시키거나 탁도를 측정한 후 인산염 완충액을 사용하여 성장하는 조류 배양의 농도를 5g/L로 조정하여 이를 수행합니다.
   참고: 살아있는 조류 배양에서 수행된 측정은 탁도 보정 곡선의 정밀도에 따라 더 큰 오류가 발생하는 경우가 많습니다. 건조된 샘플을 재현탁하려면 바이오매스를 완전히 분산시키기 위해 균질기를 사용해야 할 수 있습니다.
4. 각 샘플에 대해 80μl의 30% 에탄올 용액, 10μl의 나일 레드 용액 및 10μl의 조류 현탁액을 96웰 플레이트의 단일 웰에 혼합합니다. 형광 측정의 가변성을 적절하게 설명하려면 각 샘플에 대해 5회 반복을 수행합니다.
5. 표준물질과 함께 2점 검량 곡선을 실행하여 기기 및 준비의 일상적인 변화를 고려합니다. samples.
   와 동일한 절차를 사용하여 형광 측정을 위한 표준물질을 준비합니다. 참고: 일반적으로 2개의 포인트는 기기의 재교정에 충분하며 3개의 포인트는 선형성을 확인하기 위해 실행할 수 있습니다.
6. multi-well plate reader 분광 광도계에서 형광 측정을 수행합니다. 다음 조건이 가장 일관된 결과를 산출하는 것으로 확인되었습니다.
   1. 1,200rpm으로 30초 동안 3mm 궤도를 선회합니다.
   2. 40°C에서 10분 동안 배양합니다.
   3. 1,200rpm으로 30초 동안 3mm 궤도를 선회합니다.
   4. 형광, 530nm에서 여기, 604nm에서 방출을 기록합니다.
7. 내부 표준물질의 결과를 사용하여 형광 측정을 오일 함량으로 변환합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
25ml 일회용 피펫	어부	13-676-10케이
피펫 전구	어부	제13-681-51
1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브	어부	전화: 05-408-129
40ml 원심분리 튜브(FEP)	어부	05-562-16ᄀ	유리관을 사용할 수도 있습니다.
파스퇴르 유리 피펫	어부	13-678-20씨
나일 레드	시그마	N3013-100MG
에탄올(알코올 시약 등급)	어부	AC65109-0020
Leica DMRXA2(또는 동급) 현미경	라이카	DMRXA2
Fluorescence multi-well 플레이트 리더	Thermo Lab 시스템	플루오로스칸 아센
형광 리더 소프트웨어	Thermo Lab 시스템	어센트 소프트웨어 2.6
바닥이 둥근 COSTAR 96 웰 플레이트	어부	06-443-2