Von Kossa 대동맥 혈관 평활근 세포의 염색: 동맥 내측 석회화 평가를 위한 체외 기술

초록

출처: O'Rourke, C., et al. 혈관 평활근 세포의 석회화 및 대동맥 석회화 및 염증의 영상. J. Vis. 특급 (2016).

이 비디오는 in vitro에서 혈관 평활근 세포의 동맥 내측 석회화를 평가하기 위한 염색 기술을 보여줍니다. 폰 코사 (von Kossa) 방법은 광화학 반응을 사용하여 석회화 부위에 금속성 은을 증착시키고 검은 색을 부여합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 시약의 준비

1. 쥐 대동맥 VSMC의 분리 및 석회화
   1. 대동맥 소화 솔루션:
      1. 175 U/ml 타입 2 콜라겐 분해효소와 1.25 U/ml 엘라스타아제를 함유한 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)으로 새로운 용액(수확한 대동맥당 ~3-5ml)을 준비합니다. 0.22μm 진공 구동 여과 시스템으로 용액을 멸균하고 사용할 때까지 용액을 얼음 위에 보관하십시오.
   2. 세포 매체:
      1. Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle Medium) 500ml에 10% 소 태아 혈청, 100 units/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신을 보충합니다. 사용하기 전에 매체를 37°C로 예열하십시오.
   3. 석회화 매체:
      1. 석회화 매체 A(NaPhos, 마우스 세포주에 사용):
         1. 100-500ml의 DMEM(필요에 따라 부피)을 10% 소 태아 혈청, 2mM 인산나트륨, 100단위/ml 페니실린 및 100μg/ml 스트렙토마이신으로 보충합니다. 사용하기 전에 매체를 37°C로 데우십시오.
            또는
      2. 석회화 매체 B(βGP/Asc/DEX, 마우스 또는 인간 세포주에 사용):
         1. 10% 소 태아 혈청, 10mM β-글리세로포스페이트 디소듐, 50μg/ml L-아스코르브산, 10nM 덱사메타손, 100단위/ml 페니실린 및 100μg/ml 스트렙토마이신으로 100-500ml의 DMEM(필요에 따라 부피)을 보충합니다. 사용하기 전에 매체를 37°C로 예열하십시오.

2. 마우스 해부

1. 200mg/kg의 복강내 펜토바르비탈 주사로 마우스를 안락사시킵니다.
2. 동물을 앙와위 침대에 눕히고 각 발을 보드에 테이프로 붙여 안정화합니다. 해부 현미경과 작은 가위를 사용하여 하복부에서 상부 흉부까지 이어지는 정중선을 절개합니다.
3. 집게로 피부를 벗겨내고 복막을 제거하면 복부 장기가 드러납니다. 위장 기관을 제거하고 대동맥을 횡단하지 않도록 주의하십시오.
4. 전방 횡격막을 측면 절개하고 복부를 가로질러 절개를 계속합니다. 해부 가위를 사용하여 갈비뼈 측면을 절단하고 흉골의 상부에 부착된 연조직을 제거하여 흉곽을 풀어줍니다. 흉곽을 제거하여 폐를 드러냅니다.
5. 처음에는 심장을 제자리에 두고(근위 대동맥을 식별하고 해부하는 데 도움이 되도록) 폐를 조심스럽게 제거합니다. 흉선, 기관, 식도를 조심스럽게 제거하여 대동맥이 손상되지 않도록 합니다.
6. 곧은 가는 집게와 미세 해부 가위를 사용하여 장골 분기점에서 대동맥궁으로 가는 대동맥을 둘러싼 연조직을 제거하고, 대동맥 주위 지방을 제거할 때 주의를 기울입니다(그림 1A). 대동맥궁의 큰 가지를 둘러싸고 있는 남아 있는 지방과 연조직(즉, 상완동맥, 총경동맥 및 쇄골하 동맥, 그림 1B)을 제거합니다.
   메모: 지방은 형광 이미징을 수행할 때 배경 신호를 증가시킬 수 있으므로 대동맥에서 지방을 제거하는 것이 중요합니다.
7. 흉강에서 심장을 제거하고 근위 대동맥에서 조심스럽게 분리한 다음 버립니다. 장골 분기점에서 원위 대동맥을 횡단합니다. 인슐린 주삿바늘을 사용하여 대동맥궁에서 대동맥으로 생리식염수를 주입하여 남아 있는 혈액 세포를 씻어냅니다. 대동맥궁관과 함께 대동맥을 분리하여 몸에서 완전히 제거합니다.
8. 이미징 준비가 될 때까지 대동맥을 일반 식염수에 넣고 얼음 위에 놓습니다.

3. 1차 쥐 대동맥 혈관 평활근 세포의 분리

1. 박리가 완료될 때까지 차가운 HBSS에 대동맥을 놓습니다. 남아있는 대동맥 주위 지방과 연조직을 조심스럽게 잘라내고 대동맥만 남깁니다.
2. 멸균 조직 배양 후드 아래에서 대동맥을 35mm x 10mm 조직 배양 접시에 담긴 대동맥 소화 용액으로 옮깁니다. 37°C의 인큐베이터에 30분 동안 넣고 간헐적으로 부드럽게 흔듭니다. 소화 후 대동맥은 늘어나거나 닳은 모습을 보입니다.
3. 해부 현미경과 멸균 겸자를 사용하여 내측층은 그대로 유지하면서 대동맥의 바깥쪽 외막층을 제거합니다. 외막을 제거하는 한 가지 방법은 대동맥의 한쪽 끝에서 바깥층을 벗겨내고 양말을 벗겨서 제거하는 것처럼 밑에 있는 내측층에서 제거하는 것입니다.
4. 외래층이 제거되면 남은 대동맥을 세포 배양 배지가 있는 새 조직 배양 접시에 넣고 37°C에서 5% CO₂로 2-4시간 동안 보관합니다.
5. 멸균 후드 아래에서 멸균 3mm 미세 박리 가위를 사용하여 대동맥을 1-2mm 너비의 고리로 자릅니다.
6. 이 고리를 대동맥 분해 용액이 있는 새로운 조직 배양 접시에 넣고 37°C에서 120분 동안 부드럽게 간헐적으로 흔들면서 배양합니다. 이 배양 중에 용액을 위아래로 여러 번 피펫팅하여 세포를 재현탁합니다.
7. 5ml의 따뜻한 세포 배양 배지를 분해 용액에 추가하고 15ml 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
8. 튜브를 200 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
9. 배지를 흡인하고 원하는 부피의 세포 배양 배지(예: 5ml)로 세포를 재현탁합니다.
10. 각 대동맥에서 분리된 세포의 전체 양을 25cm² 세포 배양 플라스크에 플레이트하고 37°C에서 5% CO₂로 배양합니다. 앞에서 설명한 대로 표준 기술을 사용하여 세포를 전파합니다. 배양의 초기 7-10일 동안 72-96시간마다 배지를 교체하십시오. 세포가 합류점에 가까워지면 배지를 더 자주(48시간마다) 보충합니다.
    메모: 충분한 양의 세포가 자라는 데 몇 주가 걸릴 수 있습니다.
11. 일단 합류하면 37^°C로 가열된 트립신이 있는 세포를 계대에 세웁니다^.
    1. 각 배양 플라스크에 0.5-1.0 ml의 트립신을 첨가하고 3-5 분 동안 배양하십시오. 필요에 따라 30-60 초마다 플라스크 측면을 부드럽게 두드려 표면에서 세포를 분리합니다.
    2. 세포가 플라스크 바닥에서 분리되면 트립신의 세포에 10ml의 세포 배지를 추가합니다. 200 x g에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 세포 펠릿에서 배지와 트립신을 흡인합니다. 원하는 양의 신선한 세포 배지(예: 5-10ml)에 세포를 재현탁하고 새 플라스크(일부 세포는 챔버 슬라이드로 이동)로 옮깁니다.
12. 세포의 첫 번째 통과 시, α-평활근 액틴에 대한 항체를 사용하여 앞서 설명한 바와 같이 표준 면역세포화학 기법으로 평활근 세포 계통을 확인합니다.

4. 배양된 평활근 세포의 석회화 유도

1. 3.12에서 6웰 형식으로 얻은 플레이트 셀.
   메모: 웰당 총 2.0ml의 세포 배지에서 1 x 10⁵ cells/well로 시작하는 것이 좋습니다.
2. 세포가 석회화 매체 A 또는 B에서 6웰 플레이트 형식으로 최소 7일 동안 성장할 수 있도록 합니다. 37 ° C에서 5 % CO 2로 세포를 배양합니다_.
3. 48시간마다 세포 배지를 교체하십시오.

5. von Kossa 염색 방법을 사용한 VSMC 석회화 평가

참고: 조직 또는 배양된 세포의 세포외 기질 석회화를 측정하기 위한 von Kossa 방법은 인산염 결합 칼슘 이온을 은 이온으로 치환하는 것을 기반으로 합니다. 빛과 유기 화합물이 존재할 때, 은 이온은 환원되어 금속 은으로 시각화됩니다. 모든 미반응은은 티오황산나트륨으로 처리하여 제거합니다. 폰 코사 염색을 위한 프로토콜은 다음과 같습니다.

1. 세포 배양 플레이트에서 배지를 흡입합니다.
2. 10% 포르말린 1ml에 20분 동안 실온에서 세포를 고정합니다.
3. 포르말린을 제거하고 고정 된 세포를 증류수로 5 분 동안 씻습니다.
4. 60-100W 전구 아래에서 5% 질산은 용액 1ml에 1-2시간 동안 세포를 배양합니다.
5. 질산은 용액을 흡입하고 증류수로 5분 동안 세척합니다.
6. 1ml의 5% 티오황산나트륨(w/v) 용액에 세포를 증류수에 5분 동안 넣어 미반응 은을 제거합니다.
7. 증류수로 세포를 5분 동안 헹굽니다. 3회 반복 세척합니다. von Kossa stain은 표준 도립광 현미경으로 이미징할 준비가 되어 있습니다.
8. 선택 단계: 1ml의 핵 패스트 레드로 5분 동안 카운터 스테인하고 증류수로 3회(각 5분) 세척합니다.

결과

그림 1: 야생형 마우스의 대동맥 해부.(A) 흉부 및 복부 대동맥이 총장골동맥 분기점까지 확장되는 사진은 위에 있는 장기와 대동맥 주위 지방을 제거한 후 묘사된 것입니다. (B) 상완동맥, 좌측 총경동맥 및 좌측 쇄골하 동맥이 있는 대동맥궁에 대한 집중적인 보기. 스케일 바 = 1mm.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
15ml 원뿔형 튜브	송골매	352096
알파 평활근 actin 항체	시그마	SAB2500963
챔버 슬라이드	Nunc 랩텍	154461
콜라겐 분해 효소, 유형 2	워 딩 턴	LS004176
덱사메타손	시그마	D4902
둘베코의 변형된 독수리 매체	생명 기술	11965-084
엘라스타제	시그마	1250회
소 태아 세럼	지브코	제16000-044
겸자, 가는 점	로보즈	RS-4972
집게, 톱니 모양의 전체 곡선	로보즈	RS-5138
포르말린 (10%)	전자 현미경 과학	15740
Hank's Balanced Salt 솔루션	지브코	제14025-092
바늘이 있는 인슐린 주사기	테루모	SS30M2913
L-아스코르브산	시그마	A-7506
미세해부 용수철가위(13mm)	로보즈	RS-5676
미세해부 용수철 가위(3mm)	로보즈	RS-5610
생리식염수	호스피라	TEL:TEL:0409-4888-10
핵 빠른 빨간색	시그마-알드리치	N3020
페니실린/스트렙토마이신	코 닝	30-001-CI
질산은(5%)	리카 화학 회사	6828-16
인산나트륨 이염기성 헵타하이드레이트	시그마-알드리치	에스-9390
티오황산나트륨	시그마	에스-1648
ß-글리세로인산염 디소듐 염 수화물	시그마	G9422
조직 배양 플라스크, 25cm2	송골매	353108
조직 배양 플레이트(35mm x 10mm)	송골매	353001
조직 배양 플레이트, 6웰	송골매	353046
트립신	코 닝	25-053-CI
진공 구동 여과 시스템	밀리포어	SCGP00525

년 호 년 호 년