TEM 그리드에서 바이러스 샘플의 캡슐 기반 음성 염색: 외피 바이러스의 미세 구조를 시각화하기 위한 중금속 염색 기법

초록

출처: Blancett, C. D., et al. 생물 봉쇄 내에서 바이러스 샘플의 음성 염색을 위한 캡슐 활용. J. Vis. 특급 (2017년)

이 비디오에서는 생물 봉쇄 환경 내에서 처리 캡슐을 사용하여 외피를 가진 바이러스 샘플의 음성 염색을 보여줍니다. 투과 전자 현미경을 사용하여 음성으로 염색된 바이러스를 시각화하여 나노미터 해상도로 바이러스 구조와 형태를 조사할 수 있습니다.

프로토콜

1. 2% 글루타르알데히드로 생물 봉쇄에서 불활성화를 위한 캡슐 방법, BSL-2 실험실에서 음성 염색

1. 바이러스 불활성화 절차.
   1. 생물 봉쇄 BSC 내부에서 바이러스 현탁액을 동일한 부피의 4% 글루타르알데히드와 잘 혼합하여 2% 글루타르알데히드의 최종 농도를 달성합니다.
      주의: 글루타르알데히드는 유해 화학 물질이므로 적절한 보호가 필요합니다. 글루타르알데히드는 정상적인 BSC에서 짧은 기간 동안 사용할 수 있지만 확장된 개방 시약은 덕트 BSC 또는 화학 흄 후드에서 작업해야 합니다.
   2. 포장, 오염 제거 및 BSL-2 EM 시설로 옮기기 전에 최소 24시간 동안 고정액으로 바이러스를 비활성화합니다.
2. BSL-2 EM 시설에서 피펫에 부착된 두 개의 TEM 그리드가 포함된 캡슐로 바이러스와 고정 혼합물을 흡인합니다.
3. 그리드를 수평 방향으로 하여 10분 동안 피펫을 수평으로 놓습니다.
   메모: 이는 TEM 그리드에 바이러스 입자가 고르게 분포되도록 하기 위한 것입니다.
4. 피펫을 들고 플런저를 눌러 바이러스를 폐기물 용기로 배출합니다. 40μL의 dI 물을 캡슐에 흡입하고 3번의 헹굼 주기 동안 폐기물 용기로 배출합니다.
5. 1% 우라닐 아세테이트(UA) 또는 1% 포스포텅스텐 칼륨(PTA) 40μL를 캡슐에 30초 동안 흡인합니다
   메모: 염색 시간은 바이러스 샘플에 따라 10초에서 1분까지 다양했습니다.
   주의: UA는 알파 방출체이자 누적 독소입니다. 적절한 보호 장치로 처리하십시오.
6. 피펫에서 캡슐을 제거하고 그리드의 가장자리를 여과지 조각에 닿혀 그리드를 닦아내십시오. 그리드를 자연 건조하고 후속 TEM 이미징을 위해 보관하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Formvar/탄소 코팅 TEM 그리드	SPI	3420C-메가바이트	200 메쉬 Cu Pk/100
mPrep/g 캡슐	EMS (엠에스)	85010-01	상자
mPrep/f 커플러	EMS (엠에스)	85010-11	표준 16/Pk
글루타알데디데	EMS (엠에스)	16320	50% 용액, EM 등급
우라닐 아세테이트	EMS (엠에스)	22400	가루
포스포텅스텐 칼	EMS (엠에스)	19500	가루
여과지	왓맨	1450-090	사이즈 50
Tranmission 전자 현미경	일본 전자(JEOL)	JEM-1011	템