연조직 샘플의 Eosin 염색: 특정 조직 미세 구조를 시각화하기 위한 전체 마우스 신장 염색을 위한 Eosin 기반 절차

초록

출처: Busse, M. et al., 3D X선 특정 염색 방법 및 나노스코픽 컴퓨터 단층 촬영을 사용한 연조직 샘플 이미징.J. Vis. 특급(2019년)

이 비디오는 Eosin Y 염색에 의한 전체 마우스 신장의 산성화 절차를 보여줍니다. 이 세포질 특이적 Eosin 염색 방법은 조직의 해부학적 구조를 시각화하고 식별하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. Eosin 염색 프로토콜

1. 연조직 샘플을 고정하려면 9.5mL의 4%(v/v) 포름알데히드 용액(FA)과 0.5mL의 빙초산(AA)이 포함된 고정 용액으로 50mL 원심분리 튜브를 채웁니다.
   메모: 약 10% 메탄올로 안정화된 37% 무산성 FA 용액에서 FA 용액을 갓 준비합니다. Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)로 FA 용액을 더 희석합니다. 칼슘과 마그네슘이 없는 DPBS를 선택하십시오. 희석된 FA 용액을 1개월 이상 보관하지 마십시오. 산성화 중에 고착 용액의 pH가 중성에서 약 3.
   로 변합니다. 주의: FA는 급성 장기 독성, 부식성 및 발암성이기 때문에 흄 후드의 사용은 필수이며 적절한 보호 개인 장비를 사용해야 합니다.
   1. 갓 제거한 연조직 샘플을 50mL 원심분리 튜브에 넣고 50mL 원심분리 튜브를 24-72시간 동안 냉장 보관합니다.
      메모: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
   2. 연조직 샘플을 DPBS 용액으로 1시간 동안 세척합니다.
2. 고정된 연조직 샘플(예: 전체 마우스 신장)을 염색하려면 연조직을 eosin Y 염색 용액 2mL에 넣고 샘플을 24시간 동안 배양합니다. 배양 과정에서 부드러운 흔들림(약 60rpm)을 위해 샘플을 수평 진탕판에 보관합니다.
   메모: eosin Y-염색 용액은 증류수 중 농도가 30%(w/v)입니다. 샘플이 염색 용액으로 완전히 덮이고 샘플이 샘플 용기 내에서 자유롭게 이동할 수 있도록 염색 용액의 부피를 선택하십시오. 배양 시간은 샘플마다 다를 수 있으며 그에 따라 조정해야 합니다.
3. 염색 후 샘플 용기에서 연조직 샘플을 조심스럽게 제거합니다.
   1. 셀룰로오스 티슈 페이퍼로 과도한 염색제를 조심스럽게 제거합니다.
   2. 연조직 샘플을 원뿔형 샘플 용기에 넣고 에탄올 증기 상 위에 보관하고 나중에 사용할 수 있습니다.
      메모: 원뿔형 샘플 용기에는 연조직 샘플을 촉촉하게 유지하고 인공물을 방지하기 위해 튜브 바닥에 항상 70%(v/v) 에탄올 몇 방울이 들어 있어야 합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Falcon의 50ml 원심분리기 튜브	폭스바겐	Tel.: 734-0453
포름알데히드 용액, 37%	칼 로스	CP10.2	무산성, ~10% MeOH로 안정화
빙초산	알파 에자르	36289.AP
Eosin Y 디소듐 염	시그마-알드리치	E4382	Biological Stain Commission 인증
인산염 완충 식염수(PBS)	머 크	엘1825	Dulbecco의 제형, 칼슘과 마그네슘 없음
Nalgene의 시료 튜브	칼 로스	공격력5.1
흔드는 셰이커 ST5	고양이	60281-0000
셀룰로오스 티슈 페이퍼	폭스바겐	Tel.: 115-0600
Eppendorf의 마이크로 원심분리기 튜브	폭스바겐	211-2120	안전 잠금 장치, 2.0ml
Baker에 의한 에탄올 절대 분석	폭스바겐	80252500
Sterilin의 페트리 접시
집게, USBECK Laborgeräte	폭스바겐	Tel.: 232-0096
플라스틱 파스퇴르 피펫	칼 로스	EA68.1	눈금이 매겨진 것, 1 ml