파라핀 함유 조직 절편의 H&E 염색: 헤마톡실린과 에오신 염료의 조합을 사용하여 간 조직 절편을 시각화하는 차등 염색 기법

초록

출처: Ellis, J. L et al., 제브라피쉬의 급성 알코올성 간 손상에 대한 조직학적 분석. J. Vis. 특급 (2017).

이 비디오에서는 파라핀이 포함된 조직 절편의 헤마톡실린 및 에오신 염색 기술을 설명하여 조직학을 연구합니다. 이 절차에는 조직의 탈파라핀화와 조직의 세포 염색이 포함됩니다. 염색 시 핵은 뚜렷하게 파란색으로 나타나고 세포질의 단백질은 분홍색을 나타냅니다.

프로토콜

1. 염색 용액의 준비

1. Harris hematoxylin 원액을 필터링하여 침전된 고형물을 제거합니다.
2. 필터가 원뿔을 만들도록 커피 필터를 반으로 접습니다. 액체가 필터를 통과하도록 측면 패널을 열어 이물질이 잡힐 수 있도록 합니다.
3. 필터를 깔때기 안에 넣고 깔때기를 유리 미디어 병에 넣습니다. 점차적으로 필터를 통해 스톡 헤마톡실린을 붓습니다.
   주의: 헤마톡실린은 눈 접촉, 섭취 및 흡입의 경우 위험합니다. 항상 실험복과 장갑을 착용하고 화학 물질 후드에서 원액을 취급하십시오.
4. 250mL의 ddH₂O에 125μL의 12N HCl을 첨가하여 0.05% HCl을 준비합니다.
5. 유리병에 1% 에오신 Y(aq) 25mL, 1% 플록신 B(aq) 2.5mL, 95% 에탄올 195mL, 빙초산 1mL를 결합하여 에오신 Y-플록신 B 용액 혼합물을 준비합니다. 휘젓고 잘 섞어 RT
   에 보관하십시오. 주의: Eosin Y는 눈 접촉, 섭취 및 흡입의 경우 위험합니다. 항상 실험복과 장갑을 착용하고 화학 물질 후드에서 원액을 취급하십시오.
6. 계란 물 2mL에 순수 에틸 알코올 2mL를 첨가하여 98% 에탄올을 준비합니다.
   주의: 에틸 알코올은 눈을 자극합니다. 에틸 알코올을 취급할 때는 항상 적절한 보호 장비를 착용하십시오. 또한 가연성이므로 그에 따라 취급 및 보관해야 합니다.
   참고: 급성 에탄올 처리를 수행하기 전에 매번 신선한 2% 에탄올을 준비하십시오.

2. 파라핀 단면의 Hematoxylin 및 Eosin 염색

1. 15 분 동안 100% 크실렌에서 그(것)들을 담궈서 활주를 Deparaffinize; 또 다른 15 분 동안 신선한 100%년 크실렌으로 바꾸십시오.
2. 액체가 슬라이드에서 깨끗하게 흘러나올 때까지 다음 등급의 에탄올 시리즈를 통해 슬라이드를 담그어 슬라이드를 재수화합니다. 각 용액에 대해 8-10회, 딥당 2초: 100% 에탄올, 100% 에탄올, 95% 에탄올, 95% 에탄올, 70% 에탄올, 50% 에탄올, 30% 에탄올 및 탈이온수.
   메모: 프로토콜은 여기에서 중지할 수 있으며 슬라이드는 RT에서 몇 시간 동안 물 속에 그대로 둘 수 있습니다. 필요한 경우 슬라이드를 O/N의 물에서 4°C로 보관할 수 있습니다.
3. 슬라이드를 100% 여과된 Harris hematoxylin에 4분 동안 놓고 즉시 탈이온수가 담긴 용기에 다시 옮깁니다. 섹션에서 가장 멀리 떨어진 용기의 뒤쪽 모서리로 탈이온수를 흘려보냅니다. 물이 더 이상 보라색이 아닐 때까지 용기를 주기적으로 비우십시오.
   메모: 섹션이 슬라이드에서 떨어질 수 있으므로 물이 슬라이드에 직접 흐르지 않도록 하십시오.
4. 구즈넥 라이트를 사용하여 해부 현미경에서 헤마톡실린 강도를 빠르게 확인하십시오. 슬라이드가 건조되지 않도록 하십시오. 얼룩이 원하는 강도에 도달하면 다음 단계를 계속합니다. 색상이 충분히 어둡지 않으면 슬라이드를 100% 헤마톡실린에 1분 동안 넣고 다시 확인하기 전에 물 세척을 반복하십시오.
   메모: 헤마톡실린은 에오신 염색 중에 색이 손실되지 않도록 충분히 어두워야 합니다. 그러나 세포질에서 헤마톡실린 염색이 보이면 단면이 과도하게 염색된 것입니다.
5. 슬라이드를 0.05% HCl에 두 번 담그고 즉시 깨끗한 탈이온수를 담근 용기로 다시 옮깁니다. 물을 비우고 용기에 물을 두 번 다시 채웁니다.
6. 슬라이드를 95% 에탄올로 30초 동안 옮긴 다음 95% 에탄올이 포함된 새 용기로 30초 동안 옮깁니다.
7. 슬라이드를 eosin Y-Phloxine B 용액에 2분 동안 놓고 슬라이드를 이전의 95% 에탄올 용기로 다시 옮기고 해부 현미경으로 색상의 강도를 빠르게 확인합니다. 염색이 충분하면 다음 단계로 진행합니다. 그렇지 않은 경우 30초 동안 eosin 용액으로 돌아가서 다시 확인하고 필요에 따라 반복합니다.
   메모: 충분한 에오신 염색은 밝은 분홍색이며 헤마톡실린 염색과 뚜렷한 대조를 이룹니다. 현미경으로 확인할 때 슬라이드 뒷면의 용액을 닦아내어 거짓 색상이 관찰되지 않도록 하십시오. 에오신 성분은 95% 에탄올로 구성되어 있기 때문에 95% 에탄올에서 장시간 색상 강도를 확인하면서 일부 색상이 침출될 수 있습니다.
8. 슬라이드를 100% 이소프로판올로 15초 동안 옮기고 새 100% 이소프로판올로 교체하고 슬라이드를 다시 이소프로판올에 15초 동안 넣습니다. 이 과정을 총 6회 이소프로판올 세척에 대해 반복합니다.
   주의: 이소프로판올은 눈과 호흡기를 자극하는 물질입니다. 항상 적절한 보호 장비를 착용하고 물이 튀지 않도록 하십시오. 또한 가연성이 높으므로 그에 따라 보관 및 처리해야 합니다.
   메모: 시약을 절약하려면 첫 번째(가장 분홍색) 이소프로판올 세척제만 버리십시오. 나머지 5개의 세척 용액은 1에서 5까지의 번호가 매겨진 병에 보관하여 다음 염색에 재사용할 수 있습니다. 세척제를 재사용할 때는 번호가 "1"인 병부터 시작하여 사용 후 폐기하십시오. 세척 "2"를 사용한 후에는 병 "1"에 붓는 식으로 계속합니다. 최종 세척은 항상 신선한 이소프로판올이어야 합니다.
9. 슬라이드를 100% 자일렌에 3분 동안 놓고 한 번에 하나의 슬라이드를 제거하고 커버슬립을 놓습니다.
   1. 섹션을 덮을 수 있는 충분한 장착 매체를 추가하고 100% 자일렌에 담그십시오.
      메모: 이 단계는 장착 매체의 표면을 매끄럽게 하고 기포를 제거합니다.
   2. 슬라이드 아래쪽에 커버슬립을 적용합니다.
      메모: 장착 매체는 슬라이드를 제자리로 당겨야 합니다. 커버슬립이 일직선이 아니거나 완전히 장착되지 않은 경우 제자리에 부드럽게 두드립니다.
   3. 얇은 선만 보일 때까지 종이 타월에 여분의 장착 매체를 닦아냅니다. 티슈 와이프를 자일렌에 담그고 슬라이드 뒷면을 닦아 떨어진 매체를 제거합니다. 슬라이드를 판지 조각처럼 견고하지만 움직일 수 있는 표면에 평평하게 놓습니다. 나머지 모든 슬라이드를 같은 방식으로 커버슬립합니다. 크실렌이 후드에서 10분 동안 증발하도록 합니다.
      메모: 자일렌으로 오염된 모든 물질은 증기가 빠져나가는 것을 방지하기 위해 제거하고 후드의 밀봉된 용기에 버려야 합니다.
10. 장착 매체가 RT O/N에서 경화되도록 합니다.

3. 스테인드 슬라이드의 이미징 및 보관

1. 복합 도립 현미경의 이미지 섹션.
   메모: 슬라이드는 실온에서 무기한 보관할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
95% 에탄올(EtOH)	디콘 랩스, Inc.	2801	가연성
충전된 슬라이드	피셔 사이언티픽	제12-550-16
해부 현미경	라이카 바이오시스템즈	라이카 Mz 95
Eosin-Phloxine 얼룩 세트	신입 공급	1082ᅡ
에틸 알코올	시그마-알드리치	E7023	가연성
해리스 헤마톡실린	폴리 사이언티픽 R&D Corp.	S212	자극
염산(HCl)	피셔 사이언티픽	대답144	자극
이소프로파놀	신입 공급	12094E	가연성
자일렌	피셔 사이언티픽	X3S-4	자극