전이성 집락 형성을 평가하기 위한 메틸렌 블루 염색체외(In vitro): 암 마우스 모델에서 채취한 암세포를 정량화하여 전이를 평가하기 위한 염색 절차

초록

출처: Nagai-Singer, M. A., et al. 컴퓨터 기반 이미지 분석을 사용하여 4T1 유방암 모델에서 폐 전이의 정량화를 개선합니다. J. Vis. 특급 (2020년)

이 비디오에서는 주입 후 마우스 모델의 먼 장기에서 채취한 암세포를 배양하여 얻은 염색 콜로니를 계산하여 전이성 부담을 정량화하는 메틸렌 블루 염색 절차를 설명합니다.

프로토콜

모든 동물 모델 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 조직 처리

참고: 이 섹션의 모든 단계는 멸균 기술을 사용하여 수행해야 합니다.

1. 마우스당 15mL 원뿔형 튜브에 라벨을 부착하고 각 튜브에 2.5mL의 IV형 콜라겐분해효소 혼합물과 30단위의 엘라스타제를 추가합니다. IV형 콜라겐분해효소 혼합물을 만들려면 mL당 2mg의 IV형 콜라겐분해효소 1x HBSS와 멸균 필터를 용해시킵니다. 이것은 -20 ° C에서 최대 12 개월까지 보관할 수 있으며 필요할 때 해동 할 수 있습니다.
2. 수확된 마우스 폐를 두 번째 샘플에 대해 1x HBSS 웰을 세척합니다. 집게를 사용하여 소용돌이쳐 남아 있는 피를 제거합니다. 깨끗한 폐를 3.5cm의 빈 조직 배양 플레이트로 옮깁니다. 가위로 폐를 다집니다. 2.5mL의 1x HBSS로 플레이트를 헹구고, 1x HBSS 및 폐 조각을 콜라겐 분해 효소/엘라스타제 칵테일(총 5mL)이 이미 들어 있는 15mL 원뿔형 튜브에 넣습니다.
3. 4 °C에서 75분 동안 배양합니다. 이 시간 동안 샘플을 계속 혼합하므로 튜브를 로커 또는 회전 휠에 놓습니다. 이 배양 단계에서 각 마우스에 대해 50mL 원심분리 튜브와 10cm 조직 배양 플레이트에 라벨을 부착합니다. 희석을 수행하는 경우 희석을 위해 충분한 10cm 조직 배양 플레이트에 라벨을 붙입니다.
   메모: 조직 배양 플레이트의 뚜껑에 라벨을 붙입니다. 플레이트 자체에 라벨을 붙이면 글씨가 Fiji-ImageJ 분석을 방해합니다.
4. 1x HBSS로 각 튜브의 부피를 최대 총 10mL까지 가져옵니다. 70μm 세포 여과기를 통해 각 샘플에 대해 50mL 원뿔형 튜브에 내용물을 붓습니다. 1mL 주사기의 플런저를 사용하여 스트레이너를 통해 샘플을 부드럽게 분쇄하여 더 많은 세포가 여과할 수 있도록 합니다.
5. 실온(RT)에서 350 x g에서 5분간 원심분리기를 사용합니다. 상등액을 버리고 1x HBSS 10mL로 펠릿을 세척합니다. 이 단계를 두 번 반복합니다.
6. 10mL의 60μM 6TG 완전 배양 배지(RPMI 또는 IMDM)에 펠렛을 재현탁합니다. 10cm 세포 배양 플레이트에 시료를 플레이트화하고 원하는 경우 희석 방식을 사용합니다. 37 ° C, 5 % CO₂에서 5 일 동안 배양하십시오 .
   참고: 1:2, 1:10 및 1:100은 연구 매개변수를 기반으로 경험적으로 결정해야 하는 일반적인 희석입니다.
   주의: 6TG는 독성이 있습니다. 취급 시 주의를 기울이고 폐기에 대한 모든 환경 보건 및 안전 지침을 따르십시오.

2. 염색판

1. 플레이트에서 배양 배지를 적절한 폐기물 용기에 붓습니다. 플레이트당 5mL의 희석되지 않은 메탄올을 첨가하여 세포를 고정하고 RT에서 5분 동안 배양하여 메탄올이 전체 플레이트를 덮도록 소용돌이치도록 합니다.
   주의: 메탄올은 섭취, 흡입 또는 피부에 묻으면 위험합니다. 이 단계에서는 흄 후드를 사용하십시오.
2. 플레이트에서 메탄올을 적절한 폐기물 용기에 붓습니다. 플레이트당 5mL의 증류수로 플레이트를 헹구고 적절한 폐기물 용기에 물을 붓습니다. 플레이트당 0.03% 메틸렌 블루 5mL를 추가하고 RT에서 5분 동안 배양하여 메틸렌 블루 용액이 플레이트 전체를 덮도록
소용돌이치게 합니다.
3. 메틸렌 블루를 적절한 폐기물 용기에 붓습니다. 플레이트당 5mL의 증류수로 플레이트를 다시 헹굽니다. 접시를 거꾸로 뒤집고 종이 타월로 닦아 여분의 액체를 제거합니다. 뚜껑에 접시를 놓고 RT.
   에서 밤새 공기 건조시킵니다. 메모: 전이성 군체는 파란색입니다. 플레이트가 건조되면 RT에서 무기한 보관할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
메탄올	피셔 사이언티픽	A412SK-4
메틸렌 블루	시그마-알드리치	03978-250ML
RMPI-1640 미디엄	증권 시세	2001년 30월 30
로커 또는 회전 휠	어떤	어떤
PES 멤브레인이 있는 멸균 일회용 필터	써모피셔 사이언티픽	Tel.: 568-0010
IV형 콜라겐분해효소	시그마-알드리치	C5138
3.5cm 조직 배양 플레이트	눈클론	153066
10cm 조직 배양 플레이트	피셔 사이언티픽	08-772-22
15 mL 원심분리기 튜브	피셔 사이언티픽	14-959-70씨
1X Hank's 균형 식염수(HBSS)	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	SH3026802
50 mL 원심분리기 튜브	피셔 사이언티픽	14-959-49ᅡ
70μM 세포 스트레이너	피셔 사이언티픽	Tel.: 22-363-548
70% 에탄올	시그마 알드리치	E7023	DI 물로 70%까지 희석
부 화기			5% CO2 및 37 °C를 견딜 수 있어야 합니다
집게	로보즈	RS-8100
원심 분리기	어떤	어떤	125 x g 및 300 x g를 처리할 수 있어야 합니다.
증류수	어떤	어떤
엘라스타제	MP 바이오메디컬	100617

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