세포의 주기적 산-쉬프 염색: 말초 혈액 단핵 세포에서 글리코겐 수치를 감지하는 시험관 기술

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 전혈에서 PBMC 분리

참고: 멸균 기술과 제조업체에서 멸균한 장비를 사용하여 생물 안전 캐비닛에서 이 절차를 수행하십시오.

1. 헤파린화된(항응고제) 혈액 수집 튜브에서 10-15ml의 전혈을 50ml의 멸균 원뿔형 튜브에 조심스럽게 붓습니다. 경미한 혈액 유출의 경우, 세척 조직을 사용하여 ddH₂O 및 70% EtOH로 닦으십시오.
2. 원뿔형 튜브의 혈액을 인산염 완충액 식염수(PBS 1x) pH 7.4로 1:1 비율로 희석합니다. 최대 총 부피가 30ml를 초과하지 않는지 확인하십시오.
3. 거품을 피하면서 혈청학 피펫 건을 사용하여 부드럽게 혼합합니다.
   메모: 캡에 혈액이 고이고 원심분리 중 누출되는 것을 방지하기 위해 튜브를 뒤집어 혼합하지 마십시오.
4. 새로운 13ml 용량의 원뿔형 튜브에 50ml의 Ficoll-paque(재료 표 참조)를 추가합니다. 튜브를 랙에 똑바로 세우십시오.
5. 전사 피펫을 사용하여 희석된 혈액을 채취하고 전사 피펫 팁을 상단 근처의 튜브 내벽에 대십시오. 느리고 꾸준한 압력으로 튜브의 내벽을 따라 혈액을 전달하여 자당층 위에 혈액층을 형성합니다. 모든 혈액이 이송될 때까지 이 단계를 여러 번 반복합니다.
6. 튜브를 단단히 덮고 중간 가속도를 5로 설정하고 감속을 ZERO로 설정한 스윙 로터에서 30 x g에서 30분 동안 실온에서 튜브를 원심분리합니다.
7. 튜브를 천천히 꺼내고 층을 방해하지 않고 생물 안전 캐비닛으로 다시 가져갑니다.
8. 전사 피펫을 사용하여 PBMC가 위치한 담황색 코팅(얇고 흐린 흰색 층)을 PBS/플라즈마 층과 파이콜 층 사이에 조심스럽게 수집합니다. 자당층을 모으지 말고 적혈구층을 방해하지 마십시오.
9. 버피 코트를 새로운 50ml 멸균 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 모든 PBMC를 수집하려면 1.8단계를 여러 번 반복해야 할 수 있습니다.
10. PBMC가 있는 튜브에 PBS pH 7.4를 추가하고 45ml 표시까지 채웁니다. 튜브를 완전히 흔듭니다. 소용돌이치지 마십시오.
11. 세척 1: 최대 가속 및 감속을 모두 9로 설정하고 15 x g에서 480분 동안 원심분리기를 사용합니다. 원뿔형 튜브의 바닥에서 PBMC 펠릿의 형성을 관찰합니다.
12. PBS(상등액)를 표백제 10ml가 든 플라스틱 비커에 버립니다.
13. 물결 모양의 표면(즉, 빈 랙)에 대해 부드럽게 "랙"하여 세포 펠릿을 풉니다. 소용돌이치지 마십시오.
14. 튜브에 신선한 PBS pH 7.4 25ml를 추가합니다. 하나 이상의 튜브를 처리하는 경우 이 단계에서 펠릿을 함께 모으십시오.
15. 세척 2: 최대 가속 및 감속을 모두 9로 설정하고 12 x g에서 480분 동안 튜브를 원심분리합니다.
16. PBS(상등액)를 표백제를 뿌린 플라스틱 비커에 버리십시오.
17. 물결 모양의 표면(즉, 빈 랙)에 대해 부드럽게 "랙"합니다. 소용돌이치지 마십시오.
18. 튜브에 신선한 PBS 25ml를 추가합니다.
    1. 세포 50μl를 꺼내 마이크로 원심분리기 튜브로 옮겨 생존율 계수를 확인합니다.
    2. 동일한 양(50μl)의 트리판 블루(생존력 염색제)와 피펫을 위아래로 넣어 부드럽게 섞습니다.
19. 10μl를 꺼내 혈구계에 옮겨 ml당 세포의 생존율을 확인합니다.세포/ml의 수를 기록합니다.
20. 원하는 양의 세포를 꺼내고 최대 가속 및 감속을 모두 9로 설정하고 480 x g에서 12분 동안 튜브를 원심분리합니다.
21. PBS(상등액)를 표백제와 함께 비커에 버립니다.
22. 물결 모양의 표면(즉, 빈 랙)에 대해 부드럽게 "랙"합니다. 튜브에 PBS 80μl를 추가합니다.

2. PBMC 슬라이드 만들기

1. 80μl의 세포를 현미경 슬라이드에 놓습니다. 다른 슬라이드를 사용하여 방울을 바르거나 슬라이드의 양쪽 끝에 각각 2μl씩 40방울을 떨어뜨립니다.
2. 생물 안전 캐비닛에 슬라이드를 넣어 건조시키십시오. 젖빛 면에 연필로 슬라이드에 레이블을 붙입니다.

3. 슬라이드에 샘플 고정

1. 0.5ml의 37% 포름알데히드와 4.5ml의 99% 에탄올을 혼합하여 정착액을 준비합니다.
2. 슬라이드가 건조된 후 갓 만든 고정액 2ml를 꺼내 슬라이드의 표면 전체가 덮이도록 슬라이드에 붓습니다.
3. 용액을 슬라이드에 1분 동안 그대로 둡니다. 슬라이드를 수돗물로 1분 동안 헹구고 자연 건조시킵니다.

4. negative control을 위한 아밀라아제 용액 만들기

1. 아밀라아제 분말 0.25g을 증류수 50ml에 녹인다. 깨끗한 100ml 비커에 용액을 붓습니다.
2. 슬라이드의 절반은 처리를 받고 나머지 절반은 처리되지 않은 상태로 유지되도록 슬라이드를 비커에 담근 다음 실온에서 15분 동안 배양합니다(그림 1C).
3. 슬라이드의 어느 쪽이 아밀라아제 치료를 받고 있는지 기록해 둡니다. 슬라이드 뒷면에 치료와 통제 사이의 경계를 나타내는 선을 그립니다.
4. ddH₂O로 슬라이드를 세척하여 아밀라아제 용액을 제거하고 슬라이드를 자연 건조시킵니다.

5. PAS(Periodic Acid Schiff) 염색 및 이미징 수행

참고: PAS 시약은 흡입하면 독성이 있고 부식성이 있으므로 단계는 화학 흄 후드에서 수행해야 하며 폐기물은 기관 지침에 따라 적절하게 처리해야 합니다.

1. 슬라이드를 평평한 표면에 놓고 샘플에 주기적인 산성 용액 1.50-2.00ml를 붓습니다. 실온에서 5분 동안 배양합니다.
2. 슬라이드를 증류수를 여러 번 헹굽니다.
3. 슬라이드에 Schiff 시약 1.50-2.00ml를 붓고 실온에서 15분 동안 배양합니다.
4. 슬라이드를 증류수로 5분 동안 세척하고 자연 건조시킵니다.
5. 슬라이드에 10μl의 장착 매체를 바르고 두 개의 작은 커버슬립으로 덮거나 50μl를 바르고 하나의 큰 커버슬립을 사용합니다.
6. 커버슬립 가장자리에 투명한 매니큐어를 바르고 밤새 말리십시오.

6. 100X 대물렌즈를 사용하여 양안 광학 현미경으로 이미지 획득

그림 1: PBMC에서 PAS 염색을 위한 단계별 방법론.(A) 먼저, PBMC의 분리는 피콜 구배를 통해 이루어지며, 왼쪽 패널은 원심분리 전의 제제를 보여주고, 오른쪽 패널은 PBMC를 포함하는 버피 코트가 튜브 중앙에서 관찰되는 원심분리 후를 보여줍니다.(B) 분리된 PBMC는 포르말린-에탄올 고정 용액을 사용하여 슬라이드에 고정됩니다. 슬라이드는 플라스틱 세척 병의 증류수로 부드럽게 헹굽니다. (C) 그런 다음 슬라이드를 아밀라아제 용액으로 반쯤 채운 100ml 비커에 넣고 글리코겐을 용해시킵니다. 슬라이드를 부드럽게 헹굽니다. (D) 슬라이드는 주기적인 산성 용액으로 처리되며, 여기서 당류의 산화가 일어납니다. 슬라이드는 부드럽게 헹굽니다. 이것은 과량의 주기적인 산을 제거하고 산화 단계를 중단시킵니다. (E) Schiff 시약이 슬라이드에 첨가되면 산화 단계에서 생성된 알데히드와 반응합니다. 이 무색 시약은 짙은 빨간색 자홍색 제품을 생성합니다. 슬라이드를 부드럽게 헹구어 여분의 Schiff 시약을 제거합니다.