세포의 주기적 산-쉬프 염색: 말초 혈액 단핵 세포에서 글리코겐 수치를 감지하는 시험관 기술

초록

출처: Tabatabaei Shafiei, M., et al. 주기적인 산 Schiff 염색으로 말초 혈액 단핵 세포에서 글리코겐 검출. J. Vis. 특급 (2014).

이 비디오는 in vitro에서 말초 혈액 단핵 세포의 글리코겐 수치를 평가하기 위한 주기적인 산-Schiff 염색 기술을 보여줍니다. 이 염색은 세포 내 글리코겐 과립에 자홍색을 부여하여 현미경으로 볼 수 있도록 합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 전혈에서 PBMC 분리

참고: 멸균 기술과 제조업체에서 멸균한 장비를 사용하여 생물 안전 캐비닛에서 이 절차를 수행하십시오.

1. 헤파린화된(항응고제) 혈액 수집 튜브에서 10-15ml의 전혈을 50ml의 멸균 원뿔형 튜브에 조심스럽게 붓습니다. 경미한 혈액 유출의 경우, 세척 조직을 사용하여 ddH₂O 및 70% EtOH로 닦으십시오.
2. 원뿔형 튜브의 혈액을 인산염 완충액 식염수(PBS 1x) pH 7.4로 1:1 비율로 희석합니다. 최대 총 부피가 30ml를 초과하지 않는지 확인하십시오.
3. 거품을 피하면서 혈청학 피펫 건을 사용하여 부드럽게 혼합합니다.
   메모: 캡에 혈액이 고이고 원심분리 중 누출되는 것을 방지하기 위해 튜브를 뒤집어 혼합하지 마십시오.
4. 새로운 13ml 용량의 원뿔형 튜브에 50ml의 Ficoll-paque(재료 표 참조)를 추가합니다. 튜브를....

결과

그림 1: PBMC에서 PAS 염색을 위한 단계별 방법론.(A) 먼저, PBMC의 분리는 피콜 구배를 통해 이루어지며, 왼쪽 패널은 원심분리 전의 제제를 보여주고, 오른쪽 패널은 PBMC를 포함하는 버피 코트가 튜브 중앙에서 관찰되는 원심분리 후를 보여줍니다.(B) 분리된 PBMC는 포르말린-에탄올 고정 용액을 사용하여 슬라이드에 고정됩니다. 슬라이드는 플라스틱 세척 병의 증류수로 부드럽게 헹굽니다. (C) 그런 다음 슬라이드를 아밀라아제 용액으로 반쯤 채운 100ml 비커에 넣고 글리코겐을 용해시킵니다. 슬라이드를 부드럽게 헹굽니다. (D) 슬라이드는 주기적인 산성 용액으로 처리되며, 여기서 당류의 산화가 일어납니다. 슬라이드는 부드럽게 헹굽니다. 이것.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
주기적인 산성 쉬프 키트	시그마-알드리치	395ᄂ	사용하기 전에 실온에 두십시오. 이 키트의 재료는 독성이 있고 유해합니다. 주의하십시오.
돼지 췌장에서 추출한 α-아밀라아제	시그마-알드리치	A3176
쌍안 현미경	Carl Zeiss 현미경 검사	악시오 랩 A0
글리코겐 분석 키트	시그마-알드리치	MAK016
Ficoll-Paque 플러스	VWR, GE 헬스케어	Tel.: 17-1440-02	자당의 비이온성 합성 고분자.
원심 분리기			PBMC 격리를 위해 스윙 버킷이 사용되었습니다.