조직 절편의 크레실 바이올렛 염색: 냉동 마우스 배아 절편에서 연골과 뼈를 시각화하기 위한 염색 절차

초록

출처: Wu, Meng, et al., 유전자 발현 분석을 위한 마우스 배아 연골 및 뼈의 레이저 캡처 미세 해부. J. Vis. 특급.(2019년)

이 비디오는 동결된 마우스 배아의 관상 절편에서 뼈와 연골을 시각화하기 위한 크레실 바이올렛 염색 절차를 설명합니다. 이 염색 기술은 주변 조직과 뚜렷한 색상으로 뼈와 연골을 구별하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 레이저 캡처 현미해부를 위한 시료 준비

1. 얼룩 및 탈수에 대한 용액을 준비하십시오.
   1. 얼음 위에 3개의 50mL 원심분리 튜브 각각에 80% 에탄올 45mL를 놓습니다. #1, #2 및 #3으로 레이블을 지정합니다. 에탄올을 RNase/DNase free 물로 희석합니다.
   2. 얼음 위에 50mL 원심분리 튜브에 95% 에탄올 45mL를 넣습니다.
   3. 얼음 위에 50mL 원심분리 튜브에 100% 에탄올 45mL를 놓습니다.
   4. 실온에서 50mL 원심분리 튜브에 45mL의 자일렌을 놓습니다.
      주의 : 크실렌은 흄 후드에 사용해야 합니다.
2. 장갑을 낀 손에 PEN 멤브레인 슬라이드를 올려 잠시 해동한 다음 80% 에탄올 45mL(#1 및 #2)에 각각 30초 동안 두 번 세척하고 50mL 원심분리기 튜브에서 교반하여 OCT.
   제거합니다. 알림: 염색 중에 느슨해진 OCT가 섹션을 가리는 것을 방지하기 위해 염색하기 전에 OCT를 제거하는 것이 중요합니다. 겸자는 교반에 의해 씻겨 나가지 않는 OCT를 쉽게 제거하는 데 사용할 수 있습니다.
3. 알루미늄 호일 시트에 슬라이드를 놓습니다. 0.1% 크레실 바이올과 50% 크레실 바이올렛 0.8mL를 슬라이드에 피펫팅하고 30초 동안 염색합니다. 슬라이드를 80% 에탄올 45mL(#3)로 30초 동안 세척한 다음 50mL 원심분리 튜브에 95% 에탄올, 100% 에탄올 및 자일렌 45mL를 통해 각각 30초 동안 통로를 통해 탈수합니다.
4. 섬세한 작업 와이퍼에 5분 동안 스탠드 슬라이드를 올려 자일렌과 건조한 부분을 배수합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
원심분리기 튜브	써모피셔 사이언티픽	339653	원추형 멸균 폴리프로필렌 원심분리기 튜브, 50 mL
크레실 바이올렛 아세테이트	시그마-알드리치	C5042
섬세한 작업용 와이퍼	써모피셔 사이언티픽	06-666
증류수	인비트로젠	제10977-015	DNase/RNase-프리
에탄올, 절대(200프루프)	써모피셔 사이언티픽	BP2818	분자 생물학 등급
유리 PEN 멤브레인 슬라이드	라이카 마이크로시스템즈	11505158
OCT 컴파운드	전자 현미경 과학	제102094-106
RNase 오염 제거제	시그마-알드리치	R2020	표면 청소를 위한 RNase 오염 제거제
크실렌	시그마-알드리치	214736