Crystal Violet Staining: Colony Formation Assay를 사용하여 약물 내성 암세포를 시각화하는 기법

초록

출처: Mohr, L. et al., 항유사분열제 Docetaxel에 대한 내성의 전립선암 세포 모델 생성. J. Vis. 특급 (2017)

이 비디오에서는 화학요법 약물 내성 암세포에 대한 크리스털 바이올렛 염색 절차를 사용하여 세포 생존율 분석을 시연합니다.

프로토콜

1. Colony Formation Assay에 의한 후천성 도세탁셀 내성의 기능적 특성화

참고: 이 프로토콜에서 화학저항성은 콜로니 형성 분석을 사용하여 평가되었습니다. 세포 생존율을 평가하는 데 사용되는 대체 방법(즉, MTS 분석)은 연구자의 선호도에 따라 사용할 수 있습니다.

1. 웰당 2mL의 배지를 사용하여 6웰 플레이트의 웰당 2,000개 세포(DU145 또는 22Rv1, 부모 및 도세탁셀 내성)를 플레이트화합니다.
2. 24 시간 후, Docetaxel의 농도를 증가시키는 것을 추가하십시오 (부모 세포 : 0.25, 0.5, 1, 2.5 및 5 nM; DR 세포: DU145 및 22Rv1 세포주 모두에 대해 50, 125, 250, 500 및 1,000 nM). DMSO는 가장 높은 도세탁셀 용량에 사용되는 것과 동일한 부피의 대조군으로 하나의 웰에만 추가합니다.
3. 72시간 후, 약물 함유 배지를 흡인하고 새로운 도세탁셀이 없는 배지를 추가합니다.
4. 현미경으로 집락이 보일 때까지 1-2주 동안 플레이트를 배양합니다.
5. 콜로니를 염색하려면 2-3mL PBS로 부드럽게 세척하고 조직 배양 후드 또는 흄 후드 내부에서 20분 동안 2-3mL 결정 바이올렛 용액(10% 포르말린 중 0.1% w/v)으로 배양합니다.
6. 염색 용액을 제거하고 2-3mL의 H₂O로 플레이트를 세척하고_H2O 및 공기 건조 플레이트를 제거합니다.
7. 웰을 시각화하고 마커 펜을 사용하여 수동으로 콜로니를 계수하여 결과를 분석하고(동일한 콜로니를 두 번 계수하지 않기 위해) 세포 생존율의 백분율을 그래프로 표시합니다. 그림 표현을 위해 플레이트의 디지털 이미지를 촬영합니다(그림 1).

결과

그림 1: Docetaxel-resistant cell model의 기능적 및 표현형 특성화. 72시간 동안 표시된 Docetaxel 농도로 처리된 부모 및 Docetaxel 내성 세포의 대표적인 집락 형성 분석. 모든 처리 농도에 대한 집락의 비율이 포함된 그래프에 표시됩니다. 실험은 3배이며 데이터는 평균± SD를 나타냅니다. 스케일 바 = 5mm.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DU145 셀	증권 시세	HTB-81
22Rv1 세포	증권 시세	CRL-2505
도세탁셀	Selleck 화학 물질	S1148	DMSO에서 (10mM)
6웰 조직 배양 플레이트	송골매	353046
RPMI 1640 미디엄	지브코	11875093	10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 보충
파운데이션 B 소 태아 세럼	쌍둥이자리	900208
1X 인산염 완충 식염수(PBS)	코 닝	21-040-CM
크리스탈 바이올렛	시그마-알드리치	C0775
10% 포르말린 용액	시그마-알드리치	HT501128

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