형광 은 염색: 폴리아크릴아미드 겔에서 총 단백질을 시각화하는 기술

초록

출처: Wong, A. Y. H. et al. 폴리아크릴아미드 겔에서 단백질의 형광 은 염색. J. Vis. 특급 (2019년)

이 비디오에서는 형광 프로브를 사용하여 총 단백질을 시각화하기 위한 폴리아크릴아미드 겔의 은 염색 방법을 보여줍니다.

프로토콜

1. 젤의 준비

1. 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산(MES) 완충액으로 채워진 미니 겔 탱크를 사용하여 4% - 12% Bis-Tris 단백질 젤(1mm, 15-well)로 SDS-PAGE를 수행합니다.
2. 증류수, 리튬 도데실 설페이트(LDS) 완충액 및 시료 환원제의 혼합물로 시료를 희석합니다.
3. 첫 번째 레인에 스톡의 두 배(10μL)를 로드한 다음 정상 스톡량(5μL)을 로드하고 그 후 스톡을 일련의 2배 희석(13배에서 8192배까지 희석
)합니다.
4. 200V의 일정한 볼륨에서 젤을 30분 동안 실행합니다.

2. 젤의 정착

1. 전기영동 후 40% 에탄올/10% 아세트산의 100mL 용액에 겔을 50rpm의 실온에서 2회(각각 30분 동안) 또는 4°C에서 밤새 오비탈 쉐이커에 담급니다.
2. 깨끗한 용기에 담긴 초순수에 젤을 각각 3 x 10분 동안 세척합니다. 세척 단계가 중요합니다. 형광현상단계에서 고정액의 산이 제대로 제거되지 않으면 과도한 TPE-4TA가 산에 의해 활성화되어 겔에서 강한 배경 형광을 유발합니다.

3. AgNO₃ 해결책의 준비 그리고 젤의 은 임신

1. 함침을 위한 AgNO₃ 용액 (0.0001%)을 만들기 위해, 먼저 0.01g의 AgNO₃를 초순수 10mL에 용해시켜 0.1% AgNO₃ 원액을 제조한다. 다음으로, 0.1% AgNO₃ 원액 100μL를 초순수 100mL에 추가하여 작동하는 용액을 만듭니다.
   메모: AgNO₃ 용액은 사용하기 전에 어두운 곳에 보관해야 합니다.
2. 밀봉된 유리 용기에 100rpm의 오비탈 셰이커에 1시간 동안 은 작업 용액 100mL를 젤에 함침시킵니다. 알루미늄 호일로 빛으로부터 보호되는 흄 후드 아래에서 은 함침을 수행하는 것이 중요합니다.
3. 깨끗한 용기에 초순수 (약 100mL)로 젤을 2 x 60 초 동안 세척합니다.

4. 젤의 Fluorogenic 발달

1. 염료 원액 (0.1 mM)을 준비하려면 초순수 50 mL에 TPE-4TA 염료 3.0 mg을 첨가하십시오. 용액을 몇 분 동안 초음파 처리하고 염료를 용해하는 데 도움이 되는 NaOH 용액(예: 1M)을 추가합니다.
2. 365nm UV 램프 아래에서 용액의 형광을 확인하여 염료 분자가 완전히 용해되었는지 확인합니다. 약한 솔루션 또는 비방출 솔루션만이 전체 용해를 나타냅니다.
   메모: 염료 TPE-4TA는 Xie 등에 의해 최근에 보고된 프로토콜에 따라 합성되었습니다.TPE-4TA 솔루션은 매우 안정적이며 몇 달 동안 어둠 속에 보관할 수 있습니다.
3. 100mL의 불소성 현상액(10μM)을 준비하려면 TPE-4TA 원액 10mL를 초순수 90mL에 첨가합니다. pH 측정기를 사용하여 용액의 pH를 확인하고 수산화나트륨 용액(1μM)을 사용하여 7 - 9로 조정합니다.
4. 겔을 100mL의 형광 현상 용액이 들어 있는 깨끗하고 밀봉 가능한 용기에 옮깁니다. 젤이 용액에 완전히 잠겨 있는지 확인하십시오. 용기를 밀봉합니다. 빛을 차단하고 실온에서 50rpm의 오비탈 셰이커로 밤새 흔듭니다. 또는 염색을 위해 AIE 현상 용액을 80°C로 예열한 다음 실온에 두어 배양 단계를 약 ~2시간으로 단축할 수도 있습니다.

5. 탈색 및 이미징

1. 겔을 깨끗한 용기에 옮기고 10% 에탄올 100mL에 30분 동안 탈취합니다.
   메모: 물만으로 젤을 세척할 수 있습니다. 그러나 탈진을 위해 10% 에탄올 용액을 사용하는 것이 더 시간 효율적입니다. 이렇게 하면 염색 과정을 몇 시간에서 30분으로 줄이는 데 도움이 됩니다.
2. 젤을 초순수로 5분 동안 헹굽니다.
3. 겔 문서화 기계로 365nm 채널 또는 302nm 채널에서 겔을 이미지화합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
LDS 시료 버퍼(4X)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	NP0007	시약
4-12% Bis-Tris 단백질 겔, 1.0mm, 15웰	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	NP0323BOX	프리캐스트 젤
시료 환원제(10X)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	NP0004	시약
MES SDS 러닝 버퍼(20X)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	NP0002	시약
미니 젤 탱크	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	A25977	설비
300W 전원 공급 장치(230VAC)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	PS0301	설비
염색되지 않은 단백질 사다리	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	26614	견본
질산은	시그마-알드리치	31630-25G-R	시약
에탄올	브래그 앤 컴퍼니(Bragg and co.)	42520J	시약
아세트산	J.T. 베이커	103201ᅡ	시약
Milli-Q 합성 A10	머크	-	18.2MΩ.cm의 물 제공
젤 문서화 시스템(c600 모델)	Azure 바이오시스템	-	설비