유충 초파리 포도 세포의 지질 방울 염색: BODIPY 기반 염료를 사용하여 정상 및 스트레스 조건에서 지질 방울 축적을 평가하는 기술

초록

출처: Wei, C., et al., 초파리 유충에서 Oenocytes의 해부 및 지질 방울 염색. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 친유성 형광 BODIPY 기반 염료를 사용하여 Drosophila 유충 난소세포(간세포 유사 세포)에서 지질 방울 염색을 보여줍니다. 이 세포는 발달 과정과 기아와 같은 환경 스트레스에 대한 반응으로 지질 대사를 연구하기 위한 모델 역할을 합니다.

프로토콜

1. 유충을 위한 굶주림 치료

참고: 세 번째 instar 유충의 경우, 정상적인 섭식 조건에서는 난소세포에서 검출할 수 있는 지질 방울이 거의 없거나 전혀 없지만, 굶주림과 같은 스트레스 조건에서는 난세포에서 수많은 큰 지질 방울이 유발될 수 있습니다. 이 방법을 추가로 검증하기 위해서는 이러한 유충을 전처리하여 토양 세포에서 지질 방울 생물 발생을 유도할 필요가 있습니다. 여기에서는 12시간, 24시간, 36시간의 굶주림 시간 코스를 패러다임으로 선택했습니다. 특히, 짧은 기간의 결핍(예: 3시간)은 토양 세포에서 검출 가능한 지질 방울을 유도하기에 충분합니다. 굶주림 기간은 특정 실험 목표와 설정에 따라 달라질 수 있다.

1. 굶주림을 위한 방을 만들고 치료를 조절하십시오.
   1. 기아 치료 챔버의 경우: 6cm 페트리 접시에 적절한 크기의 여과지를 놓고 여과지에 PBS 1mL를 피펫으로 넣습니다.
   2. 대조군 처리 챔버의 경우: 페트리 접시에 블루밍턴 표준 옥수수 가루 식품 5mL를 넣습니다.
2. 주걱을 사용하여 아직 음식에 굴을 파고 있는 유충이 들어 있는 음식의 최상층을 부드럽게 파내고 PBS 5mL로 채워진 페트리 접시에 옮깁니다. PBS에서 유충을 부드럽게 저어 유충에서 음식 오염을 제거하고 가능한 한 깨끗하게 만듭니다.
3. 작은 붓을 사용하여 대략적인 크기와 같은 3번째 인스타 유충 40마리를 수집합니다. 각각 20마리의 애벌레가 있는 굶주린 방 또는 통제실에 무작위로 분류하십시오.
4. 인큐베이터의 챔버를 25°C, 습도 60%로 놓고 12시간, 24시간 및 36시간 동안 진행할 수 있습니다.
   참고: 굶주림실에 있는 유충의 경우 유충 탈수를 방지하기 위해 12시간마다 PBS 1mL를 추가하십시오.

2. Oenocyte의 해부

1. 작은 붓을 사용하여 적절한 연령(처리 후 12시간, 24시간 또는 36시간)의 유충을 선택한 다음 5mL의 얼음처럼 차가운 PBS를 채운 새 페트리 접시에 옮겨 씻습니다.
   알림: 식품 오염을 제거하기 위해 제어실에서 유충을 처리할 때 2.2단계를 반복합니다.
2. 해부 플레이트에 얼음처럼 차가운 PBS를 채우고 집게를 사용하여 유충을 해부 플레이트로 부드럽게 옮깁니다. 다음 해부 단계를 위해 해부 플레이트를 실체 현미경 아래에 놓습니다.
   알림: 얼음처럼 차가운 온도는 유충의 움직임을 늦추고 해부를 용이하게 하는 데 도움이 됩니다.
3. 유충의 복부 쪽을 위로 돌리고 등쪽을 아래로 돌리고 집게를 사용하여 부드럽게 제자리에 고정합니다. 앞쪽 끝에 있는 인두를 통해 박리 핀을 배치하고 뒤쪽 끝에 있는 스피라클을 통해 다른 핀을 배치하여 유충을 박리 플레이트에 고정합니다.
   참고: 등쪽은 기관의 등쪽 몸통의 존재로 가장 쉽게 식별할 수 있습니다.
4. Vannas 스프링 가위를 사용하여 전방에서 후방까지 표피를 통해 (세로로) 절개합니다.
5. forceps.
   를 사용하여 표피의 내부 조직을 제거합니다. 참고: 표피 내부 표면에 국한된 이엔세포의 손상을 방지하기 위해 기관 가지를 제거할 때 주의
해야 합니다.
6. 겸자로 박리 핀을 꺼내 표피를 얼음 위에 PBS로 채워진 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
7. 위에서 설명한 절차에 따라 다른 유충을 계속 해부합니다.

3. 지질 방울 염색

1. 절개된 표피를 고정 완충액에 30분 동안 로테이터의 실온(RT)에서 배양합니다.
   메모: 고정 버퍼에는 PBS에 4%의 파라포름알데히드(PFA)가 포함되어 있습니다.
2. 고정 버퍼를 제거한 다음 빠르게 세척하십시오. 빠른 세척을 수행하려면 PFA 제거 후 RT에서 PBS 1mL를 튜브에 추가하고 조직을 부드럽게 재현탁한 다음 PBS.
   를 폐기합니다. 주의: 정착 완충액에는 인체 건강에 유해한 PFA가 포함되어 있습니다. 정착 완충액을 유해 폐기물로 적절하게 처리하는 것이 중요합니다.
3. PBS로 샘플을 각각 5분 동안 3회 세척하여 가능한 모든 PFA 잔류물을 씻어냅니다.
4. BODIPY 493/503(1μg/mL, 재료 표 참조)으로 회전자의 RT에서 30분 동안 표피를 배양합니다.
   메모: 이 단계부터는 미세 원심분리기 튜브를 알루미늄 호일 조각으로 감싸 샘플이 빛으로부터 보호되고 광표백 가능성을 최소화합니다.
5. BODIPY 493/503 염색 용액을 제거하고 PBS로 샘플을 각각 10분 동안 3회 세척하여 잔류 염료를 완전히 제거합니다.

4. 마운팅 및 이미징

1. 깨끗한 현미경 슬라이드에 6μL의 장착 매체를 놓습니다.
   메모: 장착 매체는 퇴색 방지 특성에 따라 더 긴 감지 시간을 위해 사용됩니다.
2. 집게를 사용하여 표피 하나를 집어 올리고 물티슈로 잔여 PBS를 부드럽게 제거합니다.
3. 장착 매체에 표피를 배치하고 이엔세포를 포함하는 내부 표면이 아래쪽에 있고 외부 표면이 위쪽에 오도록 방향을 조정합니다.
4. 커버슬립을 표피에 부드럽게 놓습니다.
   메모: 필요한 경우 물티슈로 커버슬립 아래에서 누출되는 추가 장착 매체를 제거합니다. 이미징을 용이하게 하려면 현미경을 통해 슬라이드를 관찰할 때 단일 평면에서 이엔세포 클러스터를 쉽게 이미지화할 수 있도록 집게로 커버슬립을 부드럽게 누릅니다. 또는 조직을 장착할 때 표피 전체가 말려 올라가는 것을 방지하기 위해 표피를 중간선을 통해 두 개의 반 표피로 절단하는 것이 실용적입니다.
5. 커버슬립 가장자리 주위에 투명한 매니큐어를 바르고 밀봉합니다.
6. 슬라이드를 차광 샘플 상자에 넣고 매니큐어를 RT에서 건조시키면 5-10분이 소요될 수 있습니다.
7. 현미경 분석을 진행합니다. 컨포칼 현미경(최적화된 GFP 또는 FITC 필터 설정으로 63배 확대, 여기 = 488nm, 방출 = 503nm)을 사용하여 이미지를 촬영하여 배경을 최소화하면서 깨끗하고 민감한 신호를 획득합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
50 mL 원심분리기 튜브	코 닝	430829	50 밀리리터
6cm 페트리 접시	써모 피셔	150326	6cm
한천			플라이 푸드의 경우
알루미늄 호일	해당 사항 없음	해당 사항 없음	빛으로부터 단풍 보호
보디피 493/503	인비트로젠	D3922	지질 방울 염색 염료
컨포칼 현미경	라이카	라이카 TSC SP5	컨포칼 이미징
옥수수 시럽			플라이 푸드의 경우
옥수수 가루			플라이 푸드의 경우
커버슬립	시토글라스	10212424C	20 × 20mm, 0.13-0.17 두께
해부 핀	해당 사항 없음	해당 사항 없음
해부 플레이트	해당 사항 없음	해당 사항 없음
여과지	해당 사항 없음	해당 사항 없음	지름 : 11 cm
정착 완충액	해당 사항 없음	해당 사항 없음	4% 파라포름알데히드(PFA) 1x PBS (PBS)
집게	뒤몽	11252-30	#5
부 화기	강남(江南)	재질 보기 SPX-380	파리 문화용
마이크로 원심분리기 튜브	액시겐	MCT-150-C	1.5 밀리리터
현미경 슬라이드	시토글라스	10127105P-G
장착 매체	VECTASHIELD안티페이드 마운팅 보통	H-1000	안티페이드 마운팅 매체
매니큐어	팬에라	AAPR419	커버슬립 밀봉
화필	해당 사항 없음	해당 사항 없음
PBS (PBS)	해당 사항 없음	해당 사항 없음	PBS(137mM NaCl, 2.7mM 1개 KCl, 10mM Na_{2} HPO_{4}, 1.8mM KH_{2} PO_{4}, pH 7.4)
회전자	Kylin-Bell 실험실 기기	WH-986
시저	Smartdata 의료	SR81	Vannas 봄 가위
콩			플라이 푸드의 경우
주걱	해당 사항 없음	해당 사항 없음
표준 옥수수 가루 식품	해당 사항 없음	해당 사항 없음	블루밍턴 표준에 따라 옥수수 가루 음식 조리법
실체 현미경	라이카	라이카 S6E	조직 해부용
종이 닦기	해당 사항 없음	해당 사항 없음
효모			플라이 푸드의 경우

년 시리즈 가루