방법 논문

아밀로이드 침전물의 hFTAA 염색: 조직 절편에서 형광 이미징을 위해 올리고티오펜 기반 염료를 사용하여 아밀로이드 피브릴을 시각화하는 기술

2025년 7월 8일

이 논문에서

초록

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출처: Nyström, S. et al., 초분광 공초점 현미경 및 형광 수명 이미징에 의한 발광 접합 올리고티오펜으로 염색된 아밀로이드 조직 이미징. J. Vis. 특급 (2017).

이 비디오는 형광 이미징을 위해 발광 결합 올리고티오펜 염료(헵타머-포르밀 티오펜 아세트산 또는 hFTAA)를 사용하여 조직 절편의 아밀로이드를 염색하는 기술에 대해 설명합니다. 아밀로이드는 β장이 풍부한 비정상 단백질 응집체입니다. 조직 샘플에서 이들을 검출하면 아밀로이드 관련 질환 또는 단백병증의 진단 및 치료에 도움이 됩니다.

프로토콜

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1. LCO 염색 용액

참고: 상업용 공급업체에서 hFTAA를 구매한 경우 섹션 1 대신 공급업체의 지침을 따르십시오.

  1. 동결건조된 hFTAA를 2mM NaOH에 재현탁시켜 1mg/mL의 원액을 준비합니다. 육수를 4°C의 유리병에 보관합니다. 재고는 1년 동안 보관할 수 있습니다.
  2. 염색 당일에는 인산염 완충 식염수(PBS)에 스톡을 1:10,000으로 희석하여 작업 용액을 준비합니다.

2. 조직 샘플의 준비

참고: hFTAA를 아밀로이드 마커로 사용하여 많은 조직 유형을 이미지화할 수 있습니다. 예는 그림 1을 참조하십시오. hFTAA는 응집체 형태에 민감합니다. 따라서 염색은 항원결정기에 노출되지 않은 중단되지 않은 응집체에서 수행하는 것이 바람직합니다. 최적의 스펙트럼 품질은 조직 고정이 최소로 유지되는 경우 달성됩니다. 따라서 염색 시 에탄올에 부드럽게 고정된 신선한 냉동 재료가 선호됩니다. 그러나, 예를 들어 포르말린으로 고정된 조직에서도 아밀로이드 침착물을 검출할 수 있습니다. hFTAA는 일반적으로 조직을 잘 관통합니다. 의도한 이미징 기술과 호환되는 표본 두께를 선택합니다.

  1. 포르말린이 고정된 경우 파라핀이 포함된 절편이 사용되며 하룻밤 동안 자일렌에서 파라핀이 제거됩니다. 99% 에탄올, 70% 에탄올, dH2O 및 PBS의 연속 수조에 각각 10분씩 섹션을 담그십시오. 주변 조건에서 조직 절편이 건조되도록 합니다. 주의: 자일렌은 항상 화학 흄 후드에서 취급됩니다. 크실렌 및 기타 유기 용제는 유해합니다.
    1. 실온에서 저온 절편을 해동합니다. 조직 절편을 10% 포르말린으로 하룻밤 동안 고정하고 99% 에탄올, 70% 에탄올, dH2O 및 PBS의 연속 수조에 각각 10분씩 담궈 수분을 보충합니다. 주변 조건에서 조직 절편이 건조되도록 합니다.
  2. hFTAA 작업 용액(약 200μL)의 방울을 조직 절편에 추가하여 덮습니다. 액적은 표면 장력에 의해 제자리에 유지되어야 합니다. 염색을 위해 실온에서 30분 동안 배양합니다.
  3. 피펫을 사용하여 500μL PBS로 염색 용액을 헹군 다음 슬라이드를 PBS 수조에 10분 동안 담그고 주변 조건에서 섹션을 건조시킵니다.
  4. 형광 장착 매체를 사용하여 장착합니다. 장착 매체가 밤새 정착되도록 합니다.
    참고: hFTAA 염색은 면역형광, 세포 또는 소기관 특이적 마커 등과 같은 다른 염색 방법과 함께 수행할 수 있습니다. 동시 염색을 수행하려면 선택한 전체 염색 프로토콜을 실행하고 2.2단계부터 시작하여 마지막에 hFTAA 염색을 추가합니다. 예는 그림 2를 참조하십시오. 면역형광의 경우, 640nm 이상에서 여기된 2차 항체를 선택하는 것이 좋습니다. 이 파장 범위에서 hFTAA는 흡수하지 않으므로 여기할 수 없고 형광을 발하지 않습니다. 이를 통해 hFTAA와 항체 사이에 블리드스루가 보이지 않습니다.

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결과

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그림 1: h-FTAA 염색을 보여주는 다양한 조직 유형 및 단백질 응집체: (a) 간 내 케라틴 응집체로 구성된 Mallory-Denk 몸체(DAPI로 대조염색), (b) 산발성 봉입체-신체 근염(s-IBM) 근육 조직에서 p62-양성 r 함유, (c) 인간 췌장에서 섬 아밀로이드 폴리펩티드의 아밀로이드, (d) 인간 장에서 면역글로불린 경쇄의 아밀로이드, (e) 마우스 뇌의 양 스크래피(프리온), (f) 마우스 뇌의 만성 소모성 질환(프리온), (g) APP23 마우스 뇌의 Aβ 플라크, (h) APP/PS1 마우스 뇌의 Aβ 병리학,...

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공개 사항

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선언된 이해 상충이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
hFTAA/아미트래커545 에바 바이오텍
Dako 형광 장착 매체애질런트 기술 GM304
라이카DM6000 라이카
루멘 200 이전의
스펙트라뷰 시스템 ASI 스펙트럼 이미징

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