주석산염 저항성 산성 포스파타제 염색: TRAP 효소 함유 배양 골세포를 검출하기 위한 체외 기술

초록

출처: Dai, Q., et al. RANKL 기반 골수 배양 분석으로 골세포 형성에서 mTORC1의 역할을 조사합니다. J. Vis. 특급 (2018).

이 동영상은 파골세포 내부에 TRAP을 함유한 과립의 존재를 감지하기 위한 주석산염 내성 산 인산가수분해효소 염색 기술을 보여줍니다. 이 기술은 파골세포의 세포질에 자홍색 염료 과립 침전물을 형성하여 도립 현미경으로 볼 수 있도록 합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 준비

1. 파골세포 특이적 랩터 결실 마우스(Raptor^fl/fl; Ctsk-cre, 이하 Rap^Ctsk)는 Raptor^fl/fl 마우스를 Ctsk-cre 마우스와 짝짓기합니다. 이 연구에서는 Raptor^fl/fl 마우스를 WT 대조군으로 사용합니다.
2. 고립된 뼈를 보관하기 위해 얼음이 담긴 용기를 준비하십시오.
3. 배양 배지를 준비합니다.
   1. 최소 필수 배지 알파(α-MEM)에 1x 글루타민, 페니실린-스트렙토마이신 및 10% 태아 송아지 혈청을 보충하여 α-MEM 배양 배지를 준비합니다.
   2. 50mL의 α-MEM 배지와 M-CSF로 구성된 골수 대식세포 유도 배지를 20ng/mL로 준비합니다.
   3. 50mL의 α-MEM 배지에서 각각 20ng/mL의 M-CSF 및 RANKL로 구성된 파골세포 유도 배지를 준비합니다.
4. TRAP 염색 전에 다음 완충액을 준비합니다.
   1. 아세톤 6.5mL, 시트르산염 용액 2.5mL 및 37%(vol/vol) 포름알데히드 용액 0.8mL로 구성된 고정 용액을 준비합니다.
   2. TRAP 염색액을 준비합니다.
      1. 탈이온수를 37°C로 예열합니다.
      2. 1.5mL 마이크로튜브에 100μL의 고속 석류석 GBC 염기 용액과 100μL의 아질산나트륨 용액을 넣고 30초 동안 부드럽게 뒤집어 혼합합니다. 혼합물을 2분 동안 그대로 둡니다.
      3. 탈이온수 9mL를 37°C로 예열합니다. 단계 1.4.2.2에서 디아조화된 고속 석류석 GBC 염기 용액 200μL, 나프톨 AS-BI 인산염 용액 100μL, 아세테이트 용액 400μL 및 주석산염 용액 200μL를 추가합니다.
      4. TRAP 염색 혼합물 용액을 37°C의 수조에 보관하십시오.

2. 해부 (1일차)

1. 생후 1개월 된 암컷 WT 및 Rap^Ctsk 마우스 3마리를 CO₂로 별도로 안락사시킵니다. 교육을 받은 직원이 적절한 장비로 CO₂ 흡입을 수행합니다.
2. 박테리아 오염을 방지하기 위해 6마리의 마우스를 100mL의 75% 에탄올(vol/vol)이 든 비커에 5분 동안 담근 다음 앙와위 자세로 해부 보드에 놓습니다. 경골 원위부를 수직으로 절개하고 안과 가위로 뒷다리를 따라 피부를 절개합니다.
3. 가위로 고관절의 관절 인대를 자르고 몸통에서 뒷다리를 탈구합니다.
4. 무릎 관절의 관절 인대를 자르고 경골과 대퇴골을 무릎 관절에서 조심스럽게 분리합니다. 가위로 연조직을 부드럽게 제거합니다.
5. 한 마우스의 한 유전자형에 있는 모든 뼈를 얼음 위에 2mL의 α-MEM과 함께 6웰 플레이트의 각 웰에 놓습니다.
   메모: 세포 생존력을 보존하기 위해 뼈는 이러한 조건에서 1시간 미만 동안 유지되어야 합니다.

3. 격리 (Day-1)

1. 6웰 플레이트의 한 웰에 75% 에탄올(3mL)을 채우고 다른 5웰에 α-MEM 배지(3mL)를 채웁니다.
2. 한 유전자형의 모든 뼈를 에탄올 세척에 15초 동안 넣고 α-MEM 배지로 5회 10회 뼈를 세척합니다.
3. 가위로 골단을 잘라내고 0.45mm 주사기 바늘을 골강에 삽입하고 α-MEM 배지로 골수를 50mL 원심분리 튜브로 씻어냅니다.
4. 뼈의 다른 쪽 끝에서 동일한 방법을 사용하여 골강을 세척합니다. 뼈가 창백해질 때까지 골강을 철저히 씻기 위해 최소 두 번 반복합니다.
5. 골수를 원심분리하여 800 x g 및 4°C에서 5분 동안 세포 펠릿을 얻습니다. 상층액을 흡인합니다.
6. 적혈구 용해 완충액 3mL를 원심분리 튜브에 넣고 골수를 다시 부유시키도록 부드럽게 피펫팅합니다. 원심분리기 튜브를 얼음 위에 8분 동안 두어 적혈구를 용해시킵니다.
7. 6mL의 α-MEM 배지를 원심분리 튜브에 추가하여 세포 용해를 중지합니다. 500 x g 및 4°C에서 10분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 흡입합니다.
8. 3mL의 α-MEM 배양 배지에 재현탁하고 세포를 6웰 플레이트(일반적으로 웰당 마우스 1개)에 넣습니다.
9. 37°C의 5% CO₂ 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다.

4. 도금(0일차)

1. 상층액을 15mL 원심분리 튜브로 옮겨 다음날 아침에 부착되지 않은 세포를 채취합니다.
2. 800 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 흡입합니다.
3. 4mL의 α-MEM 배양 배지에 재현탁합니다.
4. 20 μL의 세포 용액을 20 μL의 Trypan Blue와 혼합합니다. 혼합물 10μL를 계수 챔버에 추가하고 용액 mL당 세포 수를 얻습니다.
5. 적절한 부피의 α-MEM 배양 배지를 첨가하여 500,000 cells/mL의 세포 용액을 얻을 수 있습니다.
6. 500μL 및 50μL의 골수 대식세포 유도 배지를 각각 24웰 플레이트와 96웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다.
7. 500μL 및 50μL의 세포 용액을 각각 24웰 플레이트와 96웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다.
8. 37 °C에서 5 % CO₂ 인큐베이터에서 3 일 동안 배양합니다.

5. 차별화 (3-7 일차)

1. 도금 3일 후 96웰 플레이트의 각 웰에서 50μL 배지를 채취하여 -20°C에서 동결한 다음 잔류 배지를 흡인합니다.
2. 1mL 및 100μL 파골세포 유도 배지를 각각 24웰 플레이트와 96웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다.
3. 37 °C에서 2 일 동안 배양하십시오.
4. 각 웰에서 50μL의 배지를 수집하고 잔류 배지를 흡인합니다.
5. 각 웰에 파골세포 유도 배지를 추가합니다.
6. 37 ° C에서 1 일 동안 배양하십시오 .
   메모: 이 시점에서는 도립 현미경으로 크고 다핵이 많은 파골세포를 볼 수 있어야 합니다(그림 1A).
7. 파골세포가 보이지 않으면 파골세포 유도 배지를 변경하고 파골세포가 보일 때까지 매일 관찰합니다.
8. 파골세포가 형성된 후 96웰 플레이트의 각 웰에서 50μL의 배지를 수집합니다.

6. 주석산염 내성 산성 인산가수분해효소(TRAP) 염색

참고: 성숙한 파골세포는 체외 배양 6-7일 후에 존재할 수 있습니다(4단계).

1. 중간 흡입 후 1x PBS로 3회 부드럽게 씻습니다.
2. 96웰 플레이트의 각 웰에 있는 세포를 실온에서 30초 동안 100μL의 고정 용액으로 고정합니다.
3. 고정 후 고정 용액을 흡인하고 37°C로 예열된 탈이온수로 부드럽게 3회 세척합니다. 탈이온수를 흡입합니다.
4. 96웰 플레이트의 각 웰에 100μL의 TRAP 염색을 추가하고 플레이트를 37°C의 인큐베이터에 30분 동안 넣고 빛을 차단합니다.
5. 염색 후 TRAP 얼룩을 흡인하고 탈이온수로 3회 부드럽게 씻어냅니다.
6. 40X 배율에서 도립 현미경을 사용한 파골세포의 이미지.

결과

그림 1: 파골세포의 대표적인 모습.(A) 6일째 밝은야에서 관찰된 거대 파골세포. 빨간 선은 파골세포의 경계를 나타냈습니다. (B) 전형적으로 거대하고 다핵이 있는 TRAP 양성(와인 레드) 파골세포. 검은색 화살표는 다핵 파골세포의 두 핵을 나타냅니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
랩터플/플럼 마우스	잭슨 연구소	13188
Ctsk-cre 마우스			S. Kato의 선물, 도쿄 대학, 도쿄, 일본
α-MEM	코 닝	10-022-CVR
글루타민	지비코	25030081
페니실린 스트렙토마이신	지비코	15140122
태아 송아지 세럼	바이오인드	04-001-1ᄀ
재조합 마우스 M-CSF 단백질	R&D	Q3U4F9
재조합 마우스 RANKL 단백질	R&D	Q3TWY5
RBC 용해 완충액	베이오타임	C3702 (영문
트리판 블루	시그마-알드리치	302643
아세톤	상하이 화학 Co. Ltd.
구연산염 용액	시그마-알드리치	915
포름알데히드 용액	상하이 화학 Co. Ltd.
산성 인산가수분해효소, 백혈구(TRAP) 키트	시그마-알드리치	387A-1KT
Fast Garnet GBC 기본 솔루션	시그마-알드리치	3872
아질산나트륨 용액	시그마-알드리치	914
Naphthol AS-BI 인산염 솔루션	시그마-알드리치	3871
아세테이트 용액	시그마-알드리치	3863
주석산염 용액	시그마-알드리치	3873
Dulbecco의 인산염 완충 식염수	코 닝	21-031-CVR
포름알데히드 37%	시룽 사이언티픽
익스71	올림푸스
0.45mm 주사기
시저
모기 집게

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