Alizarin Red Staining: 배양된 조골세포에 의한 광물화를 시각화하는 기술

초록

출처: Kampleitner, C., et al. 뼈 재생을 위한 생체 재료에 대한 생물학적 호환성 프로파일. J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오는 Alizarin Red 염료를 사용하여 배양된 1차 조골세포에서 광물화 또는 칼슘 침착 정도를 감지하기 위한 염색 기술을 보여줍니다.

프로토콜

1. Alizarin Red S (ARS)로 염색하여 평가 한 Osteoblast (OB) 광물화

1. 배양 플레이트에서 생체 적합성 골격으로 사용되는 β-TCP(β-Tricalcium Phosphate) 디스크에 1차 골아세포(OB)를 추가합니다.
2. 광물화 배지를 첨가한 후 14일 후에 1차 OB가 포함된 웰에서 배양 배지를 흡입하고 RT에서 0.5mL의 1x PBS로 2회 헹굽니다.PBS를 흡인하고 10% 완충된 포르말린 용액 0.5mL를 RT에서 10분 동안 첨가하여 세포를 고정합니다.
3. 일회용 피펫으로 10% 완충 포르말린을 흡입하고 0.5mL의 초순수로 두 번 세척합니다.
4. 고정 OB에 초순수에 용해된 40mM ARS 염색 용액(pH 4.2) 0.25mL를 추가하고 셰이커에서 10분/분 동안 상온에서 플레이트를 100회 쉐이크합니다.
5. 일회용 피펫으로 염색 용액을 흡입하고 초순수 1mL로 헹굽니다. 이 단계를 5-10회 반복하여 비특이적 염색을 제거합니다.
   메모: 헹굼 용액은 색이 없어야 합니다.
6. 초순수를 흡입하고 차가운 PBS 1mL를 추가합니다. 상온에서 플레이트를 10분 동안 셰이커에서 100회 쉐이크/분으로 배양합니다.
7. PBS를 흡인하고, 염색된 β-TCP 디스크를 새 우물로 옮기고, 평판 스캐너로 플레이트를 스캔하여 광물화를 기록합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
β-인산삼칼슘 디스크(β-TCP, 14mm)			디스크는 1150 ° C의 온도에서 머플 용광로에서 소결 하였다. 제작에 대한 자세한 설명은 Zimmer et al (doi: 10.1002/jbm.a.34639)에서 찾을 수 있다. 샘플은 세포 배양에 사용하기 전에 UV 조사(각 면당 15분)되었습니다.
Orthovita Vitoss 폼 (β-TCP/C 폼)	오르토비타	2102-1405
아리자린 레드 S	시그마-알드리치	A5533
포르말린 용액 중성 완충 10%	시그마-알드리치	HT501128
골형성 광물화 매체(MM)			α-MEM + 10% 열 불활성화 FBS + 1% 페니실린-스트렙토마이신 + 50μg/mL 아스코르브산 + 5mM β-글리세로포스페이
인산염 완충 식염수 1x(PBS) pH 7.4	Gibco, 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	10010023
초순수: 세포 배양수 발열원 무함유	폭스바겐	L0970-500
세척 버퍼			0.05% Tween20을 1x PBS에 추가합니다.
24웰 서스펜션 배양 플레이트	그라이너 바이오 원	662102
평판 스캐너 : Epson Perfection 1200 Photo	엡손
일회용 피펫: 세럼 피펫	그라이너 바이오 원	612301
증류수	칼 로스	3478.4
일회용 피펫: 세럼 피펫	그라이너 바이오 원	612301

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