은 염색 황화 글리코사미노글리칸의 염색: 폴리아크릴아미드 겔에서 황화 글리코사미노글리칸의 시각화를 위한 염색 방법

초록

출처: LaRiviere, W. B., et al. 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 은 염색에 의한 글리코사미노글리칸 검출. J. Vis. 특급 (2021년)

이 비디오에서는 황산화 글리코사미노글리칸 올리고당 단편의 알시안 블루 및 실버 결합 염색 절차를 보여줍니다. 이 결합된 염색 기술은 폴리아크릴아미드 겔에서 서로 다른 길이의 글리코사미노글리칸 중합체 띠를 크게 증폭시킵니다.

프로토콜

1. 은 염색 프로토콜

1. 은 염색에 필요한 모든 용액을 미리 준비하십시오(표 1).
   메모: PAGE 젤이 염색되고 현상되어 정지 용액에 들어갈 때까지 PAGE 젤을 직접 만지지 마십시오. 대신 깨끗한 플라스틱이나 유리 도구를 사용하여 젤을 조작하십시오. 젤을 직접 만지면 염색 후 젤에 지문 왜곡 및 기타 눈에 띄는 아티팩트가 생깁니다.
2. 실행이 완료되면 카세트를 분해하고 탈이온수, 여과수로 채워진 깨끗한 중대형 용기에 젤을 추출합니다.
   메모: 젤을 직접 만지지 않으려면 피펫 팁이나 다른 플라스틱 물체를 사용하여 물에 잠긴 상태에서 카세트에서 젤을 부드럽게 벗겨냅니다. 젤은 깨지기 쉬울 수 있으므로 조심스럽게 다루십시오.
   1. 물을 버리십시오. Alcian blue 염색 용액에 겔을 5분 동안 염색합니다.
   2. 알시안 블루 얼룩은 버리십시오. 대부분의 Alcian blue 염색 용액이 제거될 때까지 탈이온화되고 여과된 물로 2-3x 빠르게 헹궈내거나 세척합니다.
   3. 로커에서 밤새 탈이온되고 여과된 물로 얼룩을 제거할 수 있습니다. 밤새 젤에서 잔여 얼룩이 완전히 씻겨 나올 수 있도록 충분한 양의 탈이온되고 여과된 물이 있는지 확인하십시오.
   4. 젤을 50% 메탄올로 세척합니다(총 40분, 용액 2-3회 변경).
   5. 탈이온되고 여과된 물로 젤을 30분 동안 세척합니다. 물을 버리고 총 3시간 동안 2회 더 반복하여 매번 물을 교체하십시오.
   6. 신선하고 깨끗한 용기에 젤을 질산은 염색 용액으로 30분 동안 염색합니다.
   7. 탈이온되고 여과된 물에 2-3x 빠르게 헹궈/세척하여 은 염색 용액을 완전히 제거합니다.
   8. 탈이온되고 여과된 물로 30분 동안 씻으십시오. 물을 버리고 총 2분 동안 90회 반복하여 매번 수조를 교체하십시오.
   9. 물을 버리고 현상액을 첨가하십시오.
   10. 현상액이 첨가되면 겔을 주의 깊게 관찰하고 밴드가 나타나는지 관찰하십시오. 염색의 품질과 로드된 샘플의 질량에 따라 현상은 몇 초에서 몇 분까지 걸릴 수 있습니다.
   11. 원하는 밴드가 보이면 즉시 현상액을 버리고 정지 용액으로 잠시 세척하십시오.
   12. 정지 용액 세척을 폐기하고 새 정지 용액으로 교체하십시오. 로커나 셰이커에 1시간 동안 담가둡니다.
   13. 탈이온되고 여과된 물로 밤새 세척하십시오(그러나 젤은 용액 세척을 중지한 직후 이미지화할 수 있음).

표 1: 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분리된 글리코사미노글리칸의 은 염색에 필요한 용액. 모든 용액은 사용하기 전에 여과(0.22μm)해야 합니다.

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참고: 모든 용액은 사용하기 전에 여과(0.22μm)해야 합니다.
용액	처방	구성	코멘트
알시안 블루 염색 용액(500mL)	알시안 블루 8GX 파우더	2.5골드	원하는 농도 : 0.5 % w / v
	2% V/V 빙초산	500mL
은 염색제(200mL)	탈이온수	192.7 밀리리터	얼룩 용액을 신선하게 준비하십시오; 일주일 이내에 사용하십시오.
	7.6M 수산화나트륨	2 mL	만들려면 물 10mL에 수산화나트륨 펠릿 3.04g을 넣으십시오
	수산화암모늄	3.3 밀리리터
	4M 질산은 용액	2 mL	만들려면 5mL의 물에 3.397g의 질산은을 첨가합니다. 강수를 피하기 위해 저어주면서 적게씩 추가하십시오.
현상액 (501 mL)	탈이온수	500 밀리리터	개발 용액은 신선하게 만들어서 24시간 이내에 사용해야 합니다.
	2.5% w/v 구연산	1 mL	만들려면 4mL의 탈이온수에 100mg을 첨가하십시오. 구연산은 신선하게 만들어야 합니다.
	포름알데히드	250μL
정지 용액(500mL)	탈이온수	300 밀리리터
	빙초산	20 밀리리터
	메탄올	90 밀리리터

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
알시안 블루 8GX (단색)	써모피셔 사이언티픽	AC400460100
수산화암모늄(액체)	써모피셔 사이언티픽	A669S-500	ACS 인증
Barnstead GenPure Pro 정수 시스템	써모피셔 사이언티픽	10-451-217PKG	모든 물 탈이온화/정화 시스템은 허용되는 대체품입니다
빙초산(액체)	써모피셔 사이언티픽	대답35-500	ACS 인증
메탄올(액체)	써모피셔 사이언티픽	A412-500	ACS 인증
질산은(고체)	써모피셔 사이언티픽	시즌 181-25	ACS 인증
수산화나트륨(고체)	써모피셔 사이언티픽	S392-212
진공 필터 장치, 일회용, 0.22uM 기공 PES, 500mL 용량	써모피셔 사이언티픽	569-0020	대체 용량 및 필터 재료 허용
Molecular Imager Gel Doc XR 시스템	바이오 라드	제170-8170	모든 유사한 겔 이미징 시스템은 허용 가능한 대체품입니다

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