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1. 은 염색 프로토콜
- 은 염색에 필요한 모든 용액을 미리 준비하십시오(표 1).
메모: PAGE 젤이 염색되고 현상되어 정지 용액에 들어갈 때까지 PAGE 젤을 직접 만지지 마십시오. 대신 깨끗한 플라스틱이나 유리 도구를 사용하여 젤을 조작하십시오. 젤을 직접 만지면 염색 후 젤에 지문 왜곡 및 기타 눈에 띄는 아티팩트가 생깁니다.
- 실행이 완료되면 카세트를 분해하고 탈이온수, 여과수로 채워진 깨끗한 중대형 용기에 젤을 추출합니다.
메모: 젤을 직접 만지지 않으려면 피펫 팁이나 다른 플라스틱 물체를 사용하여 물에 잠긴 상태에서 카세트에서 젤을 부드럽게 벗겨냅니다. 젤은 깨지기 쉬울 수 있으므로 조심스럽게 다루십시오.
- 물을 버리십시오. Alcian blue 염색 용액에 겔을 5분 동안 염색합니다.
- 알시안 블루 얼룩은 버리십시오. 대부분의 Alcian blue 염색 용액이 제거될 때까지 탈이온화되고 여과된 물로 2-3x 빠르게 헹궈내거나 세척합니다.
- 로커에서 밤새 탈이온되고 여과된 물로 얼룩을 제거할 수 있습니다. 밤새 젤에서 잔여 얼룩이 완전히 씻겨 나올 수 있도록 충분한 양의 탈이온되고 여과된 물이 있는지 확인하십시오.
- 젤을 50% 메탄올로 세척합니다(총 40분, 용액 2-3회 변경).
- 탈이온되고 여과된 물로 젤을 30분 동안 세척합니다. 물을 버리고 총 3시간 동안 2회 더 반복하여 매번 물을 교체하십시오.
- 신선하고 깨끗한 용기에 젤을 질산은 염색 용액으로 30분 동안 염색합니다.
- 탈이온되고 여과된 물에 2-3x 빠르게 헹궈/세척하여 은 염색 용액을 완전히 제거합니다.
- 탈이온되고 여과된 물로 30분 동안 씻으십시오. 물을 버리고 총 2분 동안 90회 반복하여 매번 수조를 교체하십시오.
- 물을 버리고 현상액을 첨가하십시오.
- 현상액이 첨가되면 겔을 주의 깊게 관찰하고 밴드가 나타나는지 관찰하십시오. 염색의 품질과 로드된 샘플의 질량에 따라 현상은 몇 초에서 몇 분까지 걸릴 수 있습니다.
- 원하는 밴드가 보이면 즉시 현상액을 버리고 정지 용액으로 잠시 세척하십시오.
- 정지 용액 세척을 폐기하고 새 정지 용액으로 교체하십시오. 로커나 셰이커에 1시간 동안 담가둡니다.
- 탈이온되고 여과된 물로 밤새 세척하십시오(그러나 젤은 용액 세척을 중지한 직후 이미지화할 수 있음).
표 1: 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분리된 글리코사미노글리칸의 은 염색에 필요한 용액. 모든 용액은 사용하기 전에 여과(0.22μm)해야 합니다.
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| 참고: 모든 용액은 사용하기 전에 여과(0.22μm)해야 합니다. |
| 용액 | 처방 | 구성 | 코멘트 |
| 알시안 블루 염색 용액(500mL) | 알시안 블루 8GX 파우더 | 2.5골드 | 원하는 농도 : 0.5 % w / v |
| 2% V/V 빙초산 | 500mL | |
| 은 염색제(200mL) | 탈이온수 | 192.7 밀리리터 | 얼룩 용액을 신선하게 준비하십시오; 일주일 이내에 사용하십시오. |
| 7.6M 수산화나트륨 | 2 mL | 만들려면 물 10mL에 수산화나트륨 펠릿 3.04g을 넣으십시오 |
| 수산화암모늄 | 3.3 밀리리터 | |
| 4M 질산은 용액 | 2 mL | 만들려면 5mL의 물에 3.397g의 질산은을 첨가합니다. 강수를 피하기 위해 저어주면서 적게씩 추가하십시오. |
| 현상액 (501 mL) | 탈이온수 | 500 밀리리터 | 개발 용액은 신선하게 만들어서 24시간 이내에 사용해야 합니다. |
| 2.5% w/v 구연산 | 1 mL | 만들려면 4mL의 탈이온수에 100mg을 첨가하십시오. 구연산은 신선하게 만들어야 합니다. |
| 포름알데히드 | 250μL | |
| 정지 용액(500mL) | 탈이온수 | 300 밀리리터 | |
| 빙초산 | 20 밀리리터 | |
| 메탄올 | 90 밀리리터 | |