집락 형성을 위한 Giemsa 염색 분석: 중간엽 줄기 세포의 증식 능력을 평가하기 위한 체외 염색 절차

초록

출처: Schlaefli, P. et al. 응고된 골수 샘플에서 중간엽 줄기 세포를 구출하는 효소 방법. J. Vis. 특급 (2015년)

이 비디오에서는 생존 가능한 콜로니를 형성하기 위한 중간엽 줄기세포의 증식 가능성을 평가하기 위한 Giemsa 염색 절차를 시연합니다. Giemsa 염색은 주로 하늘색 염료와 에오신 염료로 구성된 중성 염색으로, 전하에 따라 세포 성분에 대한 선택적 친화력을 갖습니다.

프로토콜

1. 확장 세포 배양 및 CFU 플레이트를 위한 시딩

1. 50ml의 기저 배지에 세포(적혈구 및 단핵 세포로 구성됨)를 재현탁시킵니다: 10% 소 태아 혈청(FBS), 100U/ml 페니실린, 100mg/ml 스트렙토마이신 및 2.5mg/ml 암포테리신 B가 보충된 알파-MEM. Neubauer 챔버를 사용하여 Trypan Blue 용액에서 1:10으로 희석된 세포를 계수합니다.
2. 세포 배양 플라스크에 5 x 10⁷ cells/cm² 밀도로 세포를 플레이트화하고 37°C의 가습 배양기에서 배양합니다. 가능한 경우 저산소(5% 산소) 조건을 사용합니다. CFU 분석 제어의 경우 직경 10cm의 세포 배양 접시에 10⁹ 세포를 플레이트화합니다.
3. 배양 3일 후, 중간엽 줄기세포는 세포 배양 접시에 부착되고 다른 세포는 현탁 상태를 유지합니다. 5ng/ml 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)가 보충된 기저 배지로 배지를 변경합니다. CFU 분석 대조군의 경우 세포 배양 접시도 마찬가지로 처리합니다.
4. 총 2주 동안 세포 배양을 계속하며 일주일에 3회 배지를 교환합니다. 세포가 80% 포화도를 초과하면 트립신화로 분열합니다. CFU 분석 대조군의 경우에도 마찬가지로 배지를 교환하되 2주 동안 세포를 분할하지 마십시오.

2. CFU 분석을 위한 Giemsa 염색

1. 접시 당 Giemsa 용액 10ml 준비 : 원액 (글리세롤 : 메탄올의 7.6g / l Giemsa)을 멸균 된 물에 1 : 10으로 희석합니다 (항상 새로운 작업 희석액을 준비하십시오).
2. 세포 배양 접시에서 배지를 제거하고 PBS로 세포를 세척합니다. 페트리 접시에 액체를 바를 때 매우 조심하고 세포를 씻어내지 마십시오.
3. RT에서 5분 동안 순수 메탄올로 세포를 고정합니다. 메탄올을 버립니다. Giemsa-solution을 추가하고 37°C의 가습 인큐베이터에서 60분 동안 배양합니다.
4. PBS로 두 번 씻으십시오. 먼저 종이 타월로 플레이트 헤드를 자연 건조시킵니다. 수동으로 식민지를 세십시오. 이것은 플레이트 뒷면에 마커 펜을 사용하는 것이 가장 좋습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
기초 매체 성분
펜스트렙 100X	지브코	15140122
인간 FGF-basic	페프로텍	100-18B
MEM 알파 w/ 뉴클레오시드, w/ 안정된 글루타민	아미메드	1-23S50-나
FBS 열이 비활성화됨	아미메드	2-01F36-나
암포테리신 B	애플리켐	대답1907
일반적인
PBS (PBS)	애플리켐	964.91
Giemsa 얼룩	애플리켐	A0885
소모품
Primaria 세포 피부 접시	송골매	353803
세포 배양 플라스크 - Flask T300	증권 시세	90301
설비
스트라이프 세로로지컬 피펫 5ml	코 닝	4487-200개
가습 인큐베이터 Heracells 240	써모 사이언티픽	51026331
헤레우스 멀티퓨지 1S-R	써모 사이언티픽	75004331

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